طريقة عزل رواية الصف سريرية للكلى البشرية ارتشاح الخلايا اللحمية

الهدف العام من طريقة العزل ذات الدرجة السريرية هذه هو عزل الخلايا السدوية حول الوعائية في الكلية البشرية، أو kPSC، لاستخدامها في العلاج الخلوي لمختلف أمراض الكلى. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الطب التجديدي، مثل تحديد kPSCs البشرية المناسبة لعلاج الأعصاب المركزي لأمراض الكلى والزراعة. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في كونها سريرية، وإمكانية استخدامها لتوليد عدد كافٍ من kPSCs لأغراض العلاج الخلوي.

سوف تقوم إيلين ليفيرز، وهي فنية في مختبرنا، باستعراض الاختبار الوظيفي لخلايا kPSCs. قبل البدء في إجراء عزل خلايا الكلى، قم بتوصيل صينية تروية معقمة بحمام مائي في وضع رأسي. وعندما يتم تدفئة صينية التروية بواسطة الماء، قم بتحويل الصينية إلى الوضع الأفقي، مع إبقائها متصلة بالحمام المائي، ثم ضع أنبوب L/S 25 في المضخة.

ضع ملاقط المزارع على أحد طرفي الأنبوب واترك الأنبوب يستقر في قاع الصينية. ضع شاشاً معقماً فوق الأنبوب لمنع الانسداد، وقم بتوصيل وصلة لوير (luer connector) بالطرف الآخر من الأنبوب، ثم أضف حوالي 100 milliliters من الوسط إلى الصينية وابدأ في غسل أنبوب L/S 25 بسرعة مضخة تبلغ 100 milliliters في الدقيقة. لعزل خلايا الكلى، انقل الكلية من الأكياس المعقمة المزدوجة إلى صينية التروية المعقمة، واستخدم المقص والتمزيق اللطيف لإزالة الأنسجة الدهنية المحيطة بالكلية ومحفظة الكلية.

بمجرد تحديد موقع الشريان الكلوي في الرقعة الأبهرية، استخدم المسمار الإضافي لقسطرة الشريان الكلوي، وثبّت المسمار برابط ربط معقم. ومع تشغيل المضخة، قم بتوصيل طرف أنبوب المضخة بالموصل اللوير (luer connector). ثم اغسل الكلية بالوسط الموجود في الصينية بمعدل تدفق 100 milliliter per minute.

أضف بعد ذلك 20 milliliters من collagenase و 2.5 milliliters من DNAse إلى حوض التروية، واترك الإنزيمات تهضم الكلية، مع تدوير العضو بلطف يدوياً من وقت لآخر حتى تصبح الكلية لينة ويبدأ سائل التروية في التحول إلى اللون المعتم. وتعد مدة الهضم بواسطة collagenase أمراً بالغ الأهمية، حيث تؤدي المدة القصيرة جداً إلى تكون تكتلات خلوية، بينما تؤدي المدة الطويلة جداً إلى موت الخلايا. وفي نهاية التروية الإنزيمية، قم بتدليك الكلية بلطف حتى يتم الحصول على معلق خلوي، ثم قم بإزالة المواد غير المهضومة والوتد.

أضف 50 milliliters من المصل البشري الطبيعي إلى معلق الخلايا، ثم وباستخدام المضخة بمعدل تدفق منخفض، ضع الأنبوب المتصل بالكلية فوق عدة أنابيب تجميع سعة 50 milliliter للسماح لمعلق الخلايا بالتصريف من صينية التروية إلى أنابيب التجميع. وعند الانتهاء من جمع كافة الخلايا، قم بطرد مركزي لمعلقات الخلايا، واغسل الرواسب مرتين باستخدام وسط غسيل مكمل بـ 10% من المصل البشري الطبيعي. وبعد الغسلة الثانية، أعد تعليق الرواسب في حجم من وسط زراعة الخلايا مساوٍ لحجم رواسب الخلايا.

لاستزراع خلايا الكلى الخام، أضف حوالي 1 ml من معلق الخلايا إلى 24 ml من وسط استزراع الخلايا alpha-MEM الذي يحتوي على 5% من نضيح الصفائح الدموية لكل قارورة استزراع خلايا T 175، ثم حضّن القوارير عند 37 °C و5% من CO2. وبعد يومين، قم بإزالة السائل الطافي وبقايا الخلايا، ثم غذِّ الخلايا بـ 25 ml من وسط استزراع خلايا جديد. وعندما تصل الخلايا إلى حالة الالتحام، قم بعزل الجزء الموجب لـ NG2 عن طريق الفصل المغناطيسي للخلايا، وفقاً للبروتوكولات القياسية.

بعد ذلك، يتم استزراع 4 × 10³ من الخلايا الموجبة لـ NG2 لكل سنتيمتر مربع في دورق زراعة خلايا بحجم مناسب، ثم يوضع الدورق في حاضنة زراعة الخلايا. وعندما تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 90 إلى 100%، يتم جمع السائل الطافي وغسل الخلايا الملتصقة مرتين باستخدام PBS. ثم تُفصل الخلايا باستخدام الحجم المناسب من التربسين وفقاً لحجم الدورق، مع إيقاف التفاعل باستخدام السائل الطافي المحفوظ بعد خمس دقائق.

أعد تعليق الخلايا برفق، ثم انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي بحجم مناسب للطرد المركزي، وأعد زراعة الخلايا بكثافة 4 × 10³ خلية لكل سنتيمتر مربع. في بعض الأحيان، تتوقف الخلايا عن التكاثر بعد إثراء NG2، أو تبدأ في النمو في هياكل ثلاثية الأبعاد (3D). يمكن معالجة هذه المشكلة عن طريق معالجة الخلايا بالتريبسين وإعادة زراعتها.

بعد أربعة إلى خمسة ممرات، يتم استزراع خلايا kPSCs في طبق سداسي الفجوات بتركيز 2 × 10⁵ خلية لكل 2 mL من الوسط لكل فجوة، ويتم استزراع 5 × 10⁵ من خلايا epithelials الأنيبيبات القريبة في 2 mL من وسط استزراع خلايا epithelials الأنيبيبات القريبة لكل فجوة في طبق سداسي فجوات منفصل. توضع كلتا اللوحتين في حاضنة استزراع الخلايا لمدة 48 ساعة، مع جمع السائل الطافي لخلايا kPSC في نهاية فترة الحضانة، ثم يتم إزالة السائل الطافي لخلايا epithelials الأنيبيبات القريبة واستخدام طرف ماصة أصفر لإحداث خدش في الطبقة الخلوية الأحادية في قاع كل فجوة. تُغسل الخلايا المخدوشة بمحلول PBS، ويُضاف إليها الوسط المكيف من مستنبتات الخلايا السدوية الوعائية الكلوية.

بعد ذلك، يتم تصوير الخدش عند 4 و8 و12 و24 ساعة في نفس الموضع المحدد باستخدام مجهر الحقل المضيء المقلوب لتقييم نسبة الانغلاق بمرور الوقت. تعتبر الخلايا السدوية حول الوعائية الكلوية خلايا مغزلية الشكل ملتصقة بالبلاستيك، وتكون إيجابية لعلامات الخلايا السدوية وحول الوعائية، وسلبية للعلامات CD31 وCD34 وCD45 وHLA-DR. عادةً ما يمكن الوصول إلى مجموعة متجانسة من الخلايا السدوية حول الوعائية الكلوية عند الممر الرابع، حيث تصل الخلايا إلى مرحلة الشيخوخة حول الممر التاسع أو العاشر.

في مقايسة خدش الجرح التمثيلية هذه، ولتقييم القدرة الوظيفية لخلايا kPSCs، عند إضافة الوسط المكيف من مزرعة خلايا سدوية محيطة بالأوعية الدموية في الكلية، انغلق الجرح بشكل أسرع بكثير مما حدث في الآبار المستزرعة بالوسط الضابط. بمجرد إتقان تقنية العزل الأولية التي تستغرق حوالي ساعتين، سيتطلب الأمر من شهر إلى شهرين لتوليد مجتمع متجانس من خلايا kPSC. أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم إيقاف المعالجة بإنزيم collagenase بمجرد أن تصبح الكلية لينة، وتصبح السوائل أقل شفافية.

بالإضافة إلى الإجراءات الموضحة هنا، يمكن أيضاً استخدام هذه التقنيات لعزل الخلايا السدوية حول الوعائية من أعضاء صلبة أخرى. ويمكن استخدام kPSCs المعزولة بهذه التقنية لدراسة القدرة التجددية لهذه الخلايا في عدة نماذج مختلفة من أمراض الكلى وزراعتها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادراً على عزل واستزراع kPSCs بطريقة تتوافق مع المعايير السريرية.

لا تنسَ أن العمل مع المواد البشرية ينطوي على خطر انتقال الفيروسات، لذا يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل إجراء اختبارات فيروس نقص المناعة البشرية HIV، والتهاب الكبد B، والتهاب الكبد C عند تنفيذ هذا الإجراء.