تحريض التمايز الخلوي والتصوير خلية واحدة من فيبرايو بارايموليتيكوس السباح و سوارمر الخلايا

الهدف العام من هذه الطريقة هو تحفيز التمايز الخلوي للبكتيريا Vibrio parahaemolyticus وتكوين مجموعة من الخلايا السرب المتمايزة المتاحة بسهولة لتحليل الخلية المفردة عن طريق المجهر الفلوري. ستساعد هذه الطريقة العلماء على فهم كيفية تنظيم البكتيريا للتنظيم داخل الخلايا أثناء التمايز الخلوي والتشكل. نظرا لأن تصوير الخلايا داخل المجتمعات البكتيرية يمكن أن يكون أمرا صعبا ، فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنتج مجموعة من الخلايا السرب المتمايزة الموجودة في طبقة خلية واحدة متاحة بسهولة لتحليل الفحص المجهري أحادي الخلية.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو فهم أفضل لكيفية تنظيم البكتيريا للتغيرات في دورة الخلية ، ومورفولوجيا الخلية ، والتنظيم داخل الخلايا أثناء التمايز الخلوي. يعد عرض هذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تحقيق الحث الموثوق به للتمايز الخلوي وتكوين الخلايا المتاحة لتحليل الخلية الواحدة. لتحضير محلول أجار لصنع ألواح الاحتشاد ، قم بتعليق أربعة جرامات من تسريب القلب ، أو مسحوق H.I.agar ، و 100 مل من الماء المقطر المزدوج.

قم بغلي محلول H.I.agar بحذر في فرن الميكروويف ، ورج الزجاجة من وقت لآخر حتى يذوب المسحوق. قم بتعقيم محلول أجار عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، وقم بتبريد محلول أجار إلى 60 طن 65 درجة مئوية مع التحريك المستمر. تتضمن الخطوة التالية التعامل مع 2 ، 2'Bipyridyl ، وهو شديد السمية ، لذلك يجب ارتداء القفازات ونظارات السلامة.

أضف 2 ، 2'Bipyridyl إلى التركيز النهائي البالغ 50 ميكرومولار. أضف كلوريد الكالسيوم إلى التركيز النهائي البالغ أربعة ميلامولر. تلقيح كمية صغيرة من خلايا V.parahaemolyticus من حافة مستعمرة واحدة إلى 5 ملليتر من مرق LB.

احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة شاكر حتى تصل إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر 0.8. يستغرق هذا عادة حوالي ساعتين إلى ثلاث ساعات. أثناء نمو زراعة الخلايا ، ضع الماصة من 30 إلى 35 مل من محلول H.I.agar النهائي في طبق بتري دائري بحجم 150 ملم ، واترك الأجار يتصلب.

قبل اكتشاف ثقافة الخلايا مباشرة ، جفف صفيحة الأجار في وضع مستقيم بغطاء مفتوح عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل ، أو حتى تختفي أي بقايا سائلة ، ولكن ليس بعد الآن. ضع ميكرولتر واحد من زراعة الخلايا في وسط صفيحة احتشاد H.I.agar واترك البقعة تجف. أغلق اللوحة بشريط بلاستيكي شفاف ، مع الحرص على تجنب تكوين فقاعات الهواء والطيات على الشريط.

احتضن الطبق عند 24 درجة مئوية طوال الليل. سيؤدي ذلك إلى تكوين مستعمرة سرب V.Parahaemolyticus مع مشاعل سرب تمتد من وسط المستعمرة ، كما هو موضح في مقطع فيديو الفاصل الزمني هذا. الخطوة الأولى في هذا الإجراء هي تحضير شرائح الاغاروز للفحص المجهري.

أضف غراما واحدا من الاغاروز إلى 100 مل من محلول مرق 20٪ PBS و 10٪ LB. قم بغلي المحلول بحذر في الميكروويف لإذابة الاغاروز ، ثم اتركه يبرد إلى 65 إلى 70 درجة مئوية أثناء الخلط بشريط تقليب مغناطيسي. ضع شريحة مجهر نظيفة على قسم مستو تماما من مقعد العمل.

قم بتثبيت الشريحة على المقعد عن طريق تغطية طرفي الشريحة بطبقتين من شريط الملصقات المختبري للأغراض العامة. يجب أن تكون المسافة بين قطعتي الشريط حوالي ثلاثة سنتيمترات. ماصة حوالي 250 ميكرولتر من محلول الاغاروز المعد مسبقا على السطح الزجاجي غير المغطى.

ضع شريحة مجهرية ثانية في نفس اتجاه الشريحة السفلية في الأعلى واضغط قليلا لأسفل حتى يتدفق اللاغاروز المتبقي إلى الجانبين. دع الاغاروز يتجمد لمدة دقيقة إلى دقيقتين. استخدم مشرطا لقطع أي بقايا من الاغاروز متصلة بجانبي شريحة المجهر.

عندما يتجمد الاغاروز ، اسحب الشريحة الزجاجية العلوية ببطء من الجزء السفلي بحركة أفقية. قم بإزالة الشريط ببطء من نهايات شريحة المجهر. يجب استخدام شريحة الاغاروز في أسرع وقت ممكن ، لأنها ستبدأ في الجفاف ببطء.

مباشرة قبل نقل خلايا السرب إلى شريحة المجهر ، استخدم مشرطا لقطع الشريط البلاستيكي من لوحة السرب المعدة مسبقا. أثناء استئصال أجار الاحتشاد ، من المهم توجيه القطع من الخارج إلى داخل مستعمرة الاحتشاد لتجنب تلويث مشاعل الاحتشاد بالخلايا التي تنشأ من منتصف المستعمرة. استخدم مشرطا جديدا لقطع قطعة من أجار الاحتشاد بحجم ثلاثة ملليمترات × 10 ملم من الحافة الخارجية لمستعمرة الاحتشاد ، مع التأكد من توجيه الجروح من خارج حافة المستعمرة المحتشدة إلى داخل المستعمرة.

انقل قطعة أجار الاحتشاد إلى شريحة المجهر agarose مع الخلايا التي تواجه وسادة agarose لطبع الخلايا المحتشدة على وسادة الاغاروز. بعد الانتظار لمدة 30 ثانية ، قم بإزالة قطعة الأجار بعناية من وسادة الاغاروز. ضع غطاء زجاجي على وسادة الاغاروز حيث تم طبع الخلايا.

الخلايا جاهزة الآن للفحص المجهري الفلوري. يظهر التصوير المجهري المجسم لمستعمرة سرب V.parahaemolyticus في زيادة التكبير توهجات سرب تمتد من محيط مستعمرة السرب. يتم تجميع الخلايا الموجودة في التوهجات في طبقات أحادية أو ثنائية فقط ، بينما يتم تكديس الخلايا الموجودة في منتصف مستعمرة السرب في طبقات متعددة.

كشف التصوير المجهري DIC أن التوهجات تتكون فقط من مجموعة متمايزة تماما من الخلايا السرب ، في حين أن الخلايا من وسط مستعمرة السرب أقصر بكثير ، ومن المحتمل أن تمثل مزيجا من خلايا السباح والسرب. كدليل على المبدأ ، تم إجراء التصوير المجهري DIC والفحص المجهري الفلوري على الخلايا السباحة والسرب من النوع البري V.Parahaemolyticus ، مما يعبر خارج الرحم عن بروتين الانجذاب الكيميائي الأساسي ، YFP-CheW. في خلايا السباح ، يتم توطين YFP-CheW بطريقة أحادية القطب وثنائية القطب ، ولكن في الخلايا السرب ، يكون YFP-CheW دائما موضعيا ثنائي القطب ويشكل أيضا مجموعات موضوعة بشكل عشوائي على طول الخلية.

تم عرض التغييرات في نمط توطين YFP-CheW أثناء تمايز الخلايا من السباح إلى السرب من خلال عروض توزيع البؤر والتحليلات الديموغرافية لملامح شدة التألق. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا الميكروبية لاستكشاف كيف تنظم بكتيريا Vibrio parahaemolyticus تنظيمها الداخلي خلال حالاتها المتمايزة المتميزة للخلايا السباح والسرب. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز التمايز الخلوي للبكتيريا Vibrio parahaemolyticus وكيفية إعداد مجموعة من الخلايا السرب المتمايزة لتحليل الخلية المفردة بواسطة المجهر الفلوري.

لا تنس أن Vibrio parahaemolyticus هو عامل ممرض بشري ويجب تطبيق الإجراءات واللوائح المناسبة حول كيفية التعامل مع مسببات الأمراض BSL 2 في منطقتك.