ثلاثي الأبعاد الأنسجة المهندسة الانحياز شبكات Astrocyte الخص الآليات الإنمائية وتيسير التجدد العصبي

يهدف هذا البروتوكول إلى توجيه تصنيع حزم ثلاثية الأبعاد ذاتية التجميع من سوماتا الخلايا النجمية المحاذاة طوليا والعمليات داخل عمود هيدروجيل صغير بحجم ميكرون لاستخدامه كنموذج بيولوجي عصبي في المختبر أو كعلاج متجدد عصبي. الصدمات والأمراض التنكسية العصبية ضارة بشكل خاص بالمرضى بسبب القدرة العصبية المحدودة في البيئة المثبطة التي تحد من التجدد في الجهاز العصبي المركزي. تعالج الحزم النجمية المصممة هندسيا قيود استراتيجيات العلاج الحالية من خلال محاولة تكرار السمات التشريحية العصبية الرئيسية والآليات التنموية بوساطة الخلايا الدبقية لتعزيز هجرة الخلايا المستهدفة وتحديد مسار المحاور.

إن بنية هذه السقالات الفلكية مستوحاة بشكل أساسي من العمليات الفلكية المحاذاة في الأنابيب الدبقية لتيار الهجرة المنقاري. ابدأ بتحضير محلول الاغاروز بوزن 3٪ لكل حجم و DPBS في دورق معقم. حافظ على التسخين والتقليب لمنع المحلول من التصلب قبل الأوان.

أدخل إبرة الوخز بالإبر في الفتحة السفلية لموزع المصباح. ضع أنبوبا شعريا فوق الإبرة المكشوفة وقم بتأمين الاثنين عن طريق إدخال جزء منه في القسم المطاطي لأسطوانة موزع المصباح. قم بتغطية الأسطوانة لإكمال التجميع.

انقل ملليلتر واحد من agarose السائل إلى سطح طبق بتري فارغ. أثناء الضغط على الغطاء المطاطي لموزع المصباح ، أدخل أحد طرفي الأنبوب الشعري في الاغاروز ، وحرر الضغط على الغطاء لسحب الاغاروز في الأنبوب. ضع البصلة والأنبوب وتجميعات الإبرة على طبق بتري واترك الاغاروز يتجمد داخل الأنابيب الشعرية لمدة 5 دقائق.

ثم اسحب الإبرة من الأنبوب الشعري ، تاركا العمود الصغير لا يزال يحيط بالإبرة. استخدم أطراف الأمام لدفع العمود الصغير إلى نهاية الإبرة ، ثم أمسك الإبرة فوق طبق بتري مفتوح يحتوي على DPBS وادفع العمود الصغير إلى DPBS. لتصنيع قوارب ذات أعمدة صغيرة ، والتي تسهل التعامل لاحقا مع هذه التركيبات ، ابدأ بعمل محلول أغروز بوزن 4٪ لكل حجم ، والحفاظ على تسخين المحلول وتقليبه.

استخدم الملقط لنقل عمود صغير إلى طبق بتري فارغ. بعد ذلك ، أثناء العمل تحت مجسم ، استخدم مشرطا صغيرا لتقليم الأعمدة الدقيقة إلى الطول المطلوب ، مع قطع الأطراف بزاوية 45 درجة. بعد قص ثلاثة أعمدة صغيرة أخرى ، قم بمحاذاة الأعمدة الأربعة بالتوازي.

قم بتحميل ماصة ب 50 ميكرولتر من محلول الاغاروز بنسبة 4٪ ، وقم بتوزيع خط من السائل على مجموعة الأعمدة الدقيقة لتوصيل التركيبات وتجميعها في قارب. اتركيه ليبرد لمدة 1 إلى 2 دقيقة للسماح بهلام 4٪ agarose. ثم استخدم ملقطا دقيقا لالتقاط قارب العمود الصغير بجوار جسر الاغاروز المتصل.

وانقله إلى طبق بتري يحتوي على DPBS. انقل القارب ذو العمود الصغير إلى خزانة السلامة الحيوية وقم بتعقيمه مع التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة ثلاثين دقيقة. داخل خزانة السلامة الحيوية ، قم بإعداد محلول 1 ملليغرام لكل مليلتر من الكولاجين من نوع ذيل الفئران 1 في وسط الزراعة المشتركة.

ثم ضعه على الجليد. اضبط الرقم الهيدروجيني لمحلول ECM بالحمض أو القاعدة حسب الضرورة حتى يصبح الرقم الهيدروجيني مستقرا في النطاق من 7.2 إلى 7.4. انقل القارب ذو العمود الصغير إلى طبق بتري سعة 35 أو 60 مل باستخدام ملقط.

باستخدام المجسم للتوجيه ، ضع طرف الماصة الدقيقة سعة 10 مل في أحد طرفي كل عمود دقيق وشفط لتفريغ التجويف من DPBS وفقاعات الهواء. اشحن ماصة دقيقة P10 بمحلول الكولاجين. ضع طرف 10 مل على أحد طرفي كل عمود صغير ، وقدم حلا كافيا لملء التجويف.

ثم قم بعمل خزان من ECM على طرفي العمود الصغير. بمجرد ملء جميع الأعمدة ، وسط الماصة في حلقة حول طبق بتري لمنع الأعمدة من الجفاف. احتضان الطبق الذي يحتوي على الأعمدة الدقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة على الأقل لتعزيز بلمرة الكولاجين قبل إضافة الخلايا.

بعد ذلك ، ضع طرف الماصة الدقيقة P10 في أحد طرفي العمود الدقيق وانقل ما يقرب من 5 مل من محلول الخلية إلى التجويف لملئه. بعد جلوس جميع الأعمدة الدقيقة في قارب ، احتضنها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة لتعزيز ارتباط الخلايا النجمية ب ECM. بعد فترة الحضانة ، املأ الأطباق التي تحتوي على الأعمدة الدقيقة الجالسة بعناية ب 3 أو 6 مل من وسائط الزراعة المختلطة ، لمدة 35 أو 60 مل من أطباق بتري على التوالي.

حافظ على الأعمدة الدقيقة المطلية والثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لتعزيز التجميع الذاتي لمحاذاة الحزم النجمية ، والتي يجب أن تشكل هيكلا مجمعا يشبه الكابلات بعد ست إلى عشر ساعات. بعد ساعة واحدة من الطلاء ، تكون الخلايا النجمية كروية الشكل وتنتشر في جميع أنحاء البناء. بعد خمس ساعات من الطلاء ، تبدأ الخلايا النجمية في تمديد العملية وانكماشها.

بعد ثماني ساعات من الطلاء ، اصطفت الخلايا النجمية وتقلصت. بحلول 24 ساعة بعد الطلاء ، تشكلت حزمة كثيفة من العمليات النجمية في هذا المثال. تظهر هذه الحزمة النجمية كاملة التكوين ، بعد 24 ساعة من الطلاء ، تأثير السحاب ، حيث تعلق نهايات الكابل على نهايات مميزة لجدار التجويف.

يظهر هذا الفيديو التجميع أثناء العمل ، بعد 3 إلى 10 ساعات من الطلاء. يوضح وضع العلامات المناعية للسقالات النجمية المحاذاة الطولية للعمليات النجمية. في هذه الصورة متحدة البؤر لحزمة فلكية ، تتم قراءة العلامة الفلكية GFAP.

وتظهر النوى باللون الأزرق. يسمح هذا التكبير العالي للحزمة بتصور البنية الخلوية للخلايا النجمية داخل الأعمدة الدقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على تصنيع سقالات حية تتكون من حزم فلكية محاذاة طوليا مع بنية خلوية مستوحاة بيولوجيا داخل غلاف من المواد الحيوية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تصميم استراتيجية زرع لتوصيل الحزم النجمية مع أو بدون غلاف المواد الحيوية إلى أنسجة المخ المصابة لتعزيز هجرة الخلايا الموجهة من المناطق العصبية والعمل على التوجيه إلى البيئة المكروية للجهاز العصبي المركزي المحدود. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن توسيع هذه التقنية كظاهرة بيولوجية عصبية بوساطة الخلايا الدبقية لمنصة النمذجة الحيوية المستفيدة من تقليد البيئة ثلاثية الأبعاد الأصلية والتحكم التجريبي المتأصل في الأنظمة المختبرية.