ثلاثي الأبعاد الأنسجة المهندسة الانحياز شبكات Astrocyte الخص الآليات الإنمائية وتيسير التجدد العصبي

يهدف هذا البروتوكول إلى توجيه عملية تصنيع حزم ثلاثية الأبعاد ذاتية التجميع من أجسام واستطالات الخلايا النجمية المصطفة طولياً داخل عمود مائي مجهري بحجم ميكروني، لاستخدامها كنموذج عصبي بيولوجي في المختبر أو كعلاج لتجديد الأعصاب. تُعد الإصابات والأمراض التنكسية العصبية ضارة بشكل خاص للمرضى بسبب القدرة المحدودة على توليد الخلايا العصبية في البيئات المثبطة التي تحد من التجديد في الجهاز العصبي المركزي. وتعالج الحزم النجمية المهندسة قيود استراتيجيات العلاج الحالية من خلال محاولة محاكاة السمات التشريحية العصبية الرئيسية والآليات التنموية التي تتوسطها الخلايا الدبقية لتعزيز الهجرة الموجهة للخلايا وتحديد مسار المحاور العصبية.

تستوحي بنية هذه السقالات النجمية بشكل أساسي من الزوائد النجمية المصطفة في الأنابيب الدبقية للتيار المهاجر المنقاري. ابدأ بتحضير محلول أغاروز بنسبة 3% وزناً/حجماً وDPBS في دورق معقم. حافظ على التسخين والتحريك لمنع تجمد المحلول قبل الأوان.

أدخل إبرة وخز في الفتحة السفلية لموزع الماصة (bulb dispenser). ضع أنبوباً شعرياً فوق الجزء المكشوف من الإبرة، وثبتهما معاً عن طريق إدخال جزء منه في القسم المطاطي لأسطوانة موزع الماصة. قم بتغطية الأسططوانة لإكمال عملية التجميع.

انقل 1 mL من الأجاروز السائل إلى سطح طبق بتري فارغ. وأثناء الضغط على الغطاء المطاطي للموزع ذو البصيلة، أدخل أحد طرفي الأنبوب الشعري في الأجاروز، ثم حرر الضغط عن الغطاء لسحب الأجاروز إلى داخل الأنبوب. ضع مجموعات البصيلة والأنبوب والإبرة على طبق بتري واترك الأجاروز يتصلب داخل الأنابيب الشعرية لمدة 5 دقائق.

بعد ذلك، اسحب الإبرة من الأنبوب الشعري، مع ترك العمود الدقيق محيطاً بالإبرة. استخدم طرفي ملقط لدفع العمود الدقيق إلى نهاية الإبرة، ثم أمسك الإبرة فوق طبق بتري مفتوح يحتوي على DPBS وادفع العمود الدقيق داخل الـ DPBS. لتصنيع قوارب الأعمدة الدقيقة، والتي تسهل التعامل مع هذه البنى لاحقاً، ابدأ بتحضير محلول أغاروز بتركيز 4% وزن/حجم، مع الحفاظ على تسخين المحلول وتحريكه.

استخدم الملاقط لنقل عمود دقيق إلى طبق بتري فارغ. ثم، أثناء العمل تحت المجهر التشريحي، استخدم مشرطاً دقيقاً لقص الأعمدة الدقيقة إلى الطول المطلوب، مع قص النهايات بزاوية 45 درجة. بعد قص ثلاثة أعمدة دقيقة إضافية، قم بمحاذاة الأعمدة الأربعة بشكل متوازٍ.

املأ الماصة بـ 50 µL من محلول Agarose بتركيز 4%، ثم قم بتوزيع خط من السائل فوق مصفوفة الأعمدة الدقيقة لربط البنى وتجميعها في شكل "قارب". اترك المحلول ليبرد لمدة تتراوح من 1 إلى 2 دقيقة للسماح بـ gelation لـ 4%agarose. بعد ذلك، استخدم ملقطاً دقيقاً لرفع "قارب" الأعمدة الدقيقة من خلال جسر الـ agarose الرابط.

وانقله إلى طبق بتري يحتوي على DPBS. انقل حامل العمود الدقيق إلى كابينة السلامة البيولوجية وعقمه بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة ثلاثين دقيقة. قم بتحضير محلول بتركيز 1 mg/mL من كولاجين ذيل الجرذ من النوع 1 في وسط الزراعة المشتركة داخل كابينة السلامة البيولوجية.

ثم يوضع على الثلج. يتم ضبط pH لمحلول ECM باستخدام حمض أو قاعدة حسب الضرورة حتى يستقر pH في النطاق من 7.2 إلى 7.4. تُنقل قاعدة العمود الدقيق إلى طبق بيتري سعة 35 أو 60 mL باستخدام ملقط.

باستخدام المجهر المجسم (stereoscope) للتوجيه، ضع طرف ماصة دقيقة سعة 10 µL عند أحد طرفي كل عمود دقيق وقم بالشفط لإفراغ التجويف من محلول DPBS وفقاعات الهواء. املأ ماصة دقيقة P10 بمحلول الكولاجين. ضع طرف الـ 10 µL مقابل أحد طرفي كل عمود دقيق، ثم أضف كمية كافية من المحلول لملء التجويف.

بعد ذلك، يتم سحب كمية من المادة الخلالية (ECM) باستخدام الماصة ووضعها في كلا طرفي العمود الدقيق. وبمجرد ملء جميع الأعمدة، تُوضع مادة وسط الزراعة المشتركة (coculture medium) على شكل حلقة حول طبق بتري لمنع جفاف الأعمدة. يتم تحضين الطبق الذي يحتوي على الأعمدة الدقيقة عند درجة حرارة 37 °C و 5% carbon dioxide لمدة ساعة واحدة على الأقل لتحفيز بلمرة الكولاجين قبل إضافة الخلايا.

بعد ذلك، ضع طرف الماصة الدقيقة P10 عند أحد طرفي العمود الدقيق وانقل ما يقرب من 5 mL من محلول الخلايا إلى التجويف لملئه. وبعد تثبيت جميع الأعمدة الدقيقة في حامل، قم بتحضينها عند 37 درجة مئوية و 5% من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة لتعزيز التزام الخلايا النجمية بالمادة الخلالية (ECM). وبعد انتهاء فترة التحضين، املأ الأطباق التي تحتوي على الأعمدة الدقيقة المثبتة بعناية بـ 3 أو 6 mL من وسط الزراعة المشتركة، وذلك لأطباق بتري سعة 35 أو 60 mL على التوالي.

يجب الحفاظ على الأعمدة الدقيقة المزرعة والمستنبت في درجة حرارة 37 درجة Celsius و 5% carbon dioxide لتعزيز التجميع الذاتي للحزم النجمية المصطفة، والتي من المفترض أن تشكل بنية حزمية تشبه الكابل بعد مرور ست إلى عشر ساعات. بعد ساعة واحدة من الزرع، تكون الخلايا النجمية كروية الشكل ومنتشرة في جميع أنحاء البنية. وبحلول الساعة الخامسة بعد الزرع، تبدأ الخلايا النجمية في تمديد واستطالة الاستطالات الخلوية وانقباضها.

بعد ثماني ساعات من الزرع، تكون الخلايا النجمية قد اصطفت وانكمشت. وبحلول 24 ساعة بعد الزرع، تكونت حزمة كثيفة من الاستطالات النجمية في هذا المثال. وتظهر هذه الحزمة النجمية المكتملة التكوين، بعد 24 ساعة من الزرع، تأثير "السحاب"، حيث تلتصق نهايات الكبل بنهايات متميزة من جدار اللمعة.

يوضح هذا المقطع عملية الحزم (bundling) أثناء حدوثها، بعد مرور 3 إلى 10 ساعات من الزراعة. ويُظهر الوسم المناعي للسقالات النجمية الاصطفاف الطولي للزوائد النجمية. وفي هذه الصورة المجهرية بؤرية المسافة لحزمة نجمية، يتم رصد المؤشر النجمي GFAP.

وتظهر النوى باللون الأزرق. يسمح هذا التكبير العالي للحزمة بتصور البنية الخلوية للخلايا النجمية داخل الأعمدة الدقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرًا على تصنيع سكلات حية تتكون من حزم نجمية محاذية طوليًا ذات بنية خلوية مستوحاة بيولوجيًا داخل غلاف من مادة حيوية.

بناءً على هذا الإجراء، يمكن تصميم استراتيجية زراعة لنقل الحزم النجمية، سواء كانت محاطة بالمادة الحيوية أو بدونها، إلى أنسجة الدماغ المصابة لتعزيز الهجرة الموجهة للخلايا من المناطق العصبية وتوجيهها نحو البيئة الدقيقة المحددة للجهاز العصبي المركزي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن توسيع هذه التقنية كمنصة نمذجة ذات دقة بيولوجية لدراسة الظواهر النيوروبيولوجية التي تتوسطها الخلايا الدبقية، مستفيدة من محاكاة البيئة الطبيعية ثلاثية الأبعاد والتحكم التجريبي المتأصل في الأنظمة المختبرية in vitro.