ضبط في الحصين ثيتا الفرقة في المختبر: منهجيات لتسجيل من القوارض معزولة سيبوهيبوكامبال الدائرة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تقديم إجراءات لاستخراج مستحضر الحصين بالكامل واستكشاف توليد شبكة عصبية إيقاعية باستخدام التسجيلات الميدانية والوحدوية والمشبك الرقعة بالإضافة إلى التحفيز البصري الوراثي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب للتعلم والذاكرة من خلال تسهيل دراسة الآليات الخلوية والمشبكية التي تكمن وراء التذبذبات الإيقاعية في الحصين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم مستحضرا محسنا للتحقيق في الدوائر في التذبذبات التفصيلية ، والتي تلعب دورا مهما في معلومات الذاكرة المعتمدة على الحصين.

لبدء هذا الإجراء ، ضع الدماغ على طبق التشريح في وضع رأسي ، وقم بإزالة المخيخ بشفرة حلاقة ، ثم اقطع الدماغ إلى نصفين على طول المستوى السهمي الأوسط وأعد نصفي الكرة المخية المعزولين إلى غرفة الاحتجاز. بعد ذلك ، ضع الدماغ الفردي نصف المقطع في وضع مستقيم على طبق التشريح. قم بتدوير الطبق حتى تواجه الهياكل السهمية المتوسطة المجرب ويظهر المخطط المدمج لمركب الحاجز كطبقة رقيقة على شكل كمثرى من الأنسجة الداخلية للمهاد.

بعد ذلك ، أدخل ملعقة مغلفة أسفل الحاجز وحرك الطرف لأسفل حتى يتم الوصول إلى طبق التشريح ، وقم بقطع الألياف التي تربط منطقة الحاجز بحرارة. الآن ، كرر نفس العملية على طول الحافة الأمامية للحاجز وقم بقطع الألياف التي تتصل بالجزء الأمامي من الدماغ. مع تثبيت الملعقة برفق الجزء الداخلي من القشرة فوق الحصين مباشرة في وضع رأسي ، استخدم الملعقة الدقيقة لسحب نوى المهاد وما تحت المهاد وجذع الدماغ المتبقية بعناية.

بعد ذلك ، استخدم الملعقة لقطع وإزالة الأنسجة المسحوبة. بعد ذلك ، أدخل الملعقة المطلية في البطين الجانبي أسفل الطرف المنقاري للحصين الظهري. أمسك الملعقة أفقيا ، محاذاة المستوى السهمي الأوسط للدماغ المنقسم وحركها عبر المحيط الأملس لجدران البطين ، حتى يظهر الطرف بحرارة.

أمسك الملعقة أسفل الحصين واضغط عليها برفق على الألياف المتصلة على طول الطبقة الداخلية حيث ينضم الحصين إلى القشرة العلوية ، ثم ضع الملعقة الدقيقة على الجانب الخارجي من هذه الطبقة واضغط عليها على الملعقة المطلية لتقطيع الألياف المتصلة. لإكمال الاستخراج ، قم بتدوير طبق التشريح وأدخل الملعقة المطلية أسفل الحصين البطني. أمسك الحصين برفق بالملعقة واقطع وصلات الغدد الصماء باستخدام حركة تقطيع ضد الملعقة.

بمجرد اكتمال العزل ، احتفظ بالحصين مستريحا على الطبق وأضف قطرة من محلول السكروز المثلج لإبقائه باردا. قم بقص أي قشرة وألياف متبقية بعناية وافصل الحصين عن الحاجز عن طريق وضع شفرة حلاقة برفق على القب. بعد ذلك ، انقل المستحضر إلى محلول السكروز بدرجة حرارة الغرفة واتركه يتعافى لمدة 15 إلى 30 دقيقة قبل نقله إلى غرفة التسجيل.

في هذه الخطوة ، قم بإعداد نظام التروية الذي يتم تغذيته بالجاذبية لتمكين السرعة العالية المستمرة في تدفق ACSF المؤكسج. بعد ذلك ، أوقف تدفق ACSF وانقل الحصين إلى غرفة التسجيل ، باستخدام الطرف العريض للماصة الزجاجية. اترك مستحضر السكروز المشبع يغرق ويستقر في الأسفل.

ضع المستحضر في وسط غرفة التسجيل ، مع وضع السطح الأملس ل CA1 وsubiculum في الأعلى. قم بتثبيت الحصين بأوزان صغيرة من الحاجز والأطراف الصدغية وأعد تشغيل تدفق ACSF. في هذا الإجراء، اخفض قطب LFP إلى سطح الحصين.

قم بتطوير قطب LFP من خلال طبقة المعلمة ولاحظ الزيادة في نشاط الارتفاع خارج الخلية حيث يتم اكتشاف تفريغ وحدة واحدة من الخلايا العصبية الفردية. اخفض القطب الكهربائي أكثر ولاحظ أن الارتفاع يبدأ في التلاشي مرة أخرى عندما يعبر الطرف إلى الذرة الشعاعية. لاحظ أن تذبذب الشبكة المرئي بوضوح في نطاق تردد ثيتا ، يصبح واضحا ويصل إلى أقصى سعة حيث يتم خفض موقع التسجيل من خلال الإشعاع.

لاختبار الخصائص المكانية لتذبذبات ثيتا العفوية عبر منطقة CA1 ، ضع قطبا كهربائيا ثانيا من LFP في موقع CA1 ولاحظ أن تذبذبات ثيتا CA1 تتزامن على مسافات كبيرة. لاختبار خصائص تذبذبات ثيتا عبر طبقات الحصين ، اترك قطب LFP مرجعيا في موقع الإشعاع CA1. بدءا من أعلى الطبقة oriens مباشرة ، قم بخفض قطب كهربائي ثان في طبقة خلية المعلمة ومن خلال الراديتوم.

لاحظ انعكاسا تدريجيا لإشارة LFP عبر طبقة المعلمة. لاختبار تذبذبات جاما واقتران ثيتا جاما في الحصين السليم ، ضع قطبا كهربائيا مجاليا عند حدود CA1 الفرعية وقم بخفضه حتى يجلس عند الواجهة بين المعلمة والطبقات الجزيئية. في هذا المستوى ، يمكن تسجيل جهد مجال يعرض تذبذبات جاما واضحة مع تغيرات في السعة تلك المرحلة المقفلة على إيقاع ثيتا المحلي.

بعد ذلك ، اضبط المقياس لمراقبة المقياس الزمني البطيء لاقتران ثيتا جاما. لاحظ أن انفجارات جاما تحدث في نطاقي تردد متميزين يمكن الكشف عنهما بواسطة النطاق أثناء إشارة LFP المستمرة ، في نطاق جاما البطيء والسريع. لتسجيل مشبك تصحيح الخلية بالكامل أثناء تذبذبات ثيتا الحصين في المختبر ، استخدم الفحص المجهري بالفيديو الفلوري مع تكبير منخفض وعالي الطاقة لتصور الخلايا العصبية الداخلية الإيجابية tdTomato الموجودة بالقرب من سطح مستحضر الحصين من فأر توم الكهروضوئي.

تحت عرض التكبير المنخفض للحصين ، ضع قطبا كهربائيا LFP في CA1 subiculum لمراقبة تذبذبات ثيتا أثناء التحضير لتجارب مشبك التصحيح. بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى التكبير بمقدار 40x واغمر الهدف فوق المنطقة المستهدفة. قم بخفضه حتى تصبح الطبقات العليا مرئية ، تحت الفحص المجهري الفلوري ، حدد خلية الفلورسنت الكهروضوئية واقترب بماصة رقعة مملوءة بمحلول قياسي بين الخلايا.

بمجرد دخولك إلى تكوين الخلية الكاملة ، افحص الخصائص الفسيولوجية للخلية الكهروضوئية المحددة أثناء التذبذبات العفوية في الحصين. لاحظ تسجيل إمكانات الغشاء داخل الخلايا من الخلايا الكهروضوئية التي تتميز بسلوك الارتفاع السريع وانفجارات من إمكانات الفعل المتزامنة مع إيقاع ثيتا CA1 الفرعي المستمر. في هذا الإجراء ، ضع قطبا كهربائيا LFP في منطقة CA1 الفرعية وقم بتصحيح خلية معلمة قريبة في الحصين المعزول للفأر ، معبرا عن الأوبسين الاستثاري الحساس للضوء الأزرق ، CHR2 في الخلايا العصبية الداخلية الكهروضوئية.

ضع دليل ضوء الألياف الضوئية فوق مستحضر الحصين وقم بتوسيطه على المنطقة المسجلة. استخدم الضوء الأزرق من مصدر LED للتحفيز الجيني البصري ، والذي يتكون من نبضات ضوئية من 10 إلى 20 مللي ثانية أو أوامر جهد موجة الخطيئة التي يتم تسليمها بترددات ثيتا. في المشبك الحالي ، قم بتمييز نشاط الخلية المسجلة أثناء تذبذبات ثيتا العفوية.

ثم ابدأ بروتوكول التحفيز وسجل استجابات الضوء. لاحظ أن التذبذبات الميدانية والنشاط المشبكي والخلايا العصبية المسجلة ، تصبح متزامنة بشكل متزايد أثناء التحفيز البصري الوراثي وأن الإيقاع الإيقاعي للخلايا الكهروضوئية ينتج عنه تحكم قوي في كل من تردد وقوة تذبذبات ثيتا. يظهر هنا ، هو النشاط الفيزيولوجي الكهربي المسجل من خلية معلمة أثناء تذبذبات ثيتا.

تظهر آثار المشبك الحالية إطلاق النار التلقائي ولكن ليس الإيقاعي في حالة الراحة وإمكانيات ما بعد التشابك المثبطة التي لم تتم مزامنتها بوضوح مع تذبذب LFP الناشئ ببطء. تظهر تسجيلات مشبك الجهد أن التيارات المثبطة المقابلة بعد التشابك لها إمكانات انعكاس عند حوالي 70 مللي فولت تحت الصفر. وهنا ، يتم تسجيل النشاط الفيزيولوجي الكهربي من الخلايا العصبية الكهروضوئية الفلورية سريعة الارتفاع أثناء تذبذبات ثيتا.

في المشبك الحالي ، كانت هذه الخلية تطلق تلقائيا أثناء الراحة وكانت مدفوعة بقوة بإمكانيات ما بعد التشابك الإيقاعية التي تم قفلها على مراحل مع تذبذب LFP المستقر. في تسجيلات مشبك الجهد ، كانت إمكانات انعكاس التيار المثير بعد التشابك عند صفر مللي فولت تقريبا. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات ، أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تزويد المحلول بالأكسجين بقوة واستخدام نظام التروية الذي يسمح بتدفق عالي السرعة ولكن ثابت ل ACSF المسلح على المستحضر أثناء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل تحفيز البصريات الوراثية أو إسكات مجموعات معينة من أنواع الخلايا ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد الأنواع الفرعية الخلوية التي تشكل مذبذبات ثيتا في الحصين. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف ديناميكيات تذبذبات ثيتا بشكل منهجي عبر المحور الصدغي الحاجز للحصين في المختبر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج مستحضر الحصين بالكامل من أجل استكشاف وظيفة الشبكات العصبية الإيقاعية باستخدام تسجيلات المشبك الميداني والوحدة والتصحيح ، بالإضافة إلى التحفيز البصري الوراثي.