الحبل الشوكي العصبونات العزلة والثقافة من الفئران حديثي الولادة

الهدف العام من هذا الإجراء هو أن تكون قادرا على عزل الخلايا العصبية في الحبل الشوكي بشكل متكرر ومتسق والتي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من التجارب. يمكن أن تسمح لنا هذه الطريقة باكتساب نظرة أفضل على بيولوجيا الخلايا العصبية في الحبل الشوكي ونأمل أن نفهم استجابتها لمجموعة متنوعة من الضغوط. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بعزل عدد كبير من الخلايا العصبية ، مما يسمح باستخدام تلك الخلايا العصبية في مجموعة متنوعة من التجارب.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث تتطلب خطوة التخليص حيث يتم عزل الخلايا العصبية ميكانيكيا عن الأنسجة ، بعض الوقت لإتقانها ، من أجل ضمان عزل الخلايا العصبية الصحية ، دون قتلها. لبدء هذا الإجراء ، افصل الرأس عن جسم صغار الفأر الرحيم باستخدام المقص. بعد ذلك ، قم بتثبيت الذيل والذراعين على طاولة الإجراءات بحيث يكون الجانب الظهري متجها لأعلى.

ثم اقطع الجلد باستخدام مقص القزحية المنحني. بعد ذلك ، قم بقطع الحبل الشوكي من منطقة أسفل الظهر ، فوق الوركين مباشرة ثم قم بقطع جانبي الصدر لفصله عن الجسم. اغسل العينات بالتتابع في ثلاثة أطباق بتري بحجم 10 سم ، تحتوي على خمسة ملليلتر من PBS المعقم لمدة 10 ثوان لكل منها ، لإزالة الأنسجة الزائدة.

بعد ذلك ، أدخل إبرة وحقنة قياس 22 مملوءة بخمسة ملليلتر من PBS المعقم في الطرف الذيلي للعمود الفقري وقم بغسلها في الجمجمة ، مما يسمح للسلك بالخروج إلى طبق بتري رابع. انقل الحبل الشوكي في أنبوب سعة 15 مليلتر مع خمسة ملليلتر من HABG على الثلج. تجنب سحق الحبل الشوكي وكرر الإجراءات لبقية الجراء.

من الناحية المثالية ، يجب ألا تستغرق هذه العملية أكثر من 30 دقيقة لمجموعة واحدة من الجراء ، لضمان عزل الخلايا العصبية. لتحضير تدرج الكثافة ، قم بإعداد كل طبقة من الطبقات الأربع في أربعة أنابيب سعة 15 مل. ثم أضف ملليلتر واحد من كل طبقة في أنبوب جديد سعة 15 مل.

ابدأ بالطبقة الأولى في الأسفل ، وأضفها بالتتابع ، حتى تصل إلى الطبقة الرابعة في الأعلى. تجنب إزعاج الطبقات أثناء الإضافة وأي حركات قوية قد تسبب الاختلاط. بعد ذلك ، أضف وسائط الهضم إلى الأنسجة المفرومة.

ضع العينة في شاكر في حمام مائي على حرارة 30 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنسجة من الحمام المائي واتركها تستقر لبضع دقائق. لأداء التجربة ، استنشق وسط الهضم الزائد.

قم بتعليق الأنسجة في ملليلترين من HABG ، باستخدام ماصة ضيقة التجويف ، وقم بترتيتر 10 مرات في 45 ثانية وتجنب إدخال الهواء ، لأنه سيقلل بشكل كبير من الإنتاجية القابلة للحياة. يعد الاختبار أحد أهم خطوات الإجراء ، حيث يجب سحب الأنسجة بعناية إلى الماصة المصقولة بالنار وإفراغها منها ، وتجنب النشاط الزائد الذي يمكن أن يؤدي إلى موت الخلايا العصبية أو أن تكون لطيفة جدا ، مما قد يؤدي إلى انخفاض الغلة. بعد ذلك ، استنشق أعلى ملليلترين من المادة الطافية ونقلها إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر يسمى مجموعة.

كرر إجراءات التجميع مرتين أخريين ، للحصول على ستة ملليلتر من المادة الطافية. بعد ذلك ، انقل محتويات أنبوب التجميع ببطء إلى أنبوب التدرج المعد مسبقا. تجنب تعطيل التدرج.

لتنقية الخلايا العصبية ، قم بالطرد المركزي لأنبوب التدرج لمدة 15 دقيقة عند 800 مرة G ، عند 22 درجة مئوية. اجمع الطبقات المرغوبة وانقلها في أنبوب جديد سعة 15 مل. للحصول على أعلى عزل للخلايا العصبية نقاء ، اجمع الطبقة الثالثة.

لمزيد من الغلة مع نقاء أقل ، اجمع الطبقات من اثنين إلى ثلاثة. بعد ذلك ، قم بتخفيف تدرج الكثافة عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من HABG إلى الطبقات التي تم جمعها حديثا. جهاز الطرد المركزي ، عند 200 مرة G لمدة دقيقتين عند 22 درجة مئوية.

بعد دقيقتين ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من HABG ، عن طريق النقر على الحنك. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 200 مرة G لمدة دقيقتين عند 22 درجة مئوية مرة أخرى. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من الوسط العصبي القاعدي ، عن طريق تحريك الحنك.

بعد ذلك ، حدد كثافة الخلية باستخدام عداد الخلايا ثم قم بتخفيف التعليق إلى 300 ، 000 خلية لكل مليلتر واحد من الوسط العصبي. رج العبوة برفق لتوزيع الخلايا والمحلول وإضافة مليلتر واحد من العينة إلى كل بئر في ألواح البئر 24 المشفرة. يظهر هنا ، هو المسار الزمني للخلايا العصبية في الثقافة ، بعد البذر على الآبار.

عادة ما تبدأ الخلايا في الالتصاق بالسطح خلال أول ساعتين. ستبدأ المحاور في الظهور خلال ال 24 إلى 48 ساعة الأولى ، وعادة ما تصل الروابط بين الخلايا العصبية المختلفة والثقافة إلى مرحلة النضج في سبعة أيام ، وعند هذه النقطة ، يتم إجراء التجارب عادة على الخلايا العصبية. في هذا الشكل ، يظهر التلوين النووي باللون الأزرق ، مع تلطيخ السيتوبلازم باللون الأخضر ، وهنا ، يتم تلطيخ البروتين العصبي العصبي المرتبط بالأنابيب الدقيقة المرتبط بالبروتين العصبي الثاني ، مما يدل على الخطوط العريضة والإسقاطات المحورية للخلايا العصبية بعد أسبوع في الثقافة.

يتم الجمع بين صور الدمج ، مما يدل على الوفرة النسبية للخلايا العصبية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات ، إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين ، الذين يدرسون فسيولوجيا الحبل الشوكي وعلم الأمراض ، لاستكشاف سلوك الخلايا العصبية في الحبل الشوكي في ظل الظروف العادية واستجابة للعوامل الدوائية أو الضغوطات مثل الحرمان من الأكسجين والجلوكوز ، فقط لمحاكاة إجراءاتنا الجراحية.

أثناء اتخاذ هذا الإجراء ، من المهم تجنب تأخير أو إطالة أي من الخطوات لمنع عزل الخلايا العصبية غير الصحية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا العصبية السليمة والقابلة للحياة من الحبل الشوكي للفئران حديثي الولادة التي يمكن زراعتها في وسائط خالية من المصل.