Name: إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: تعلم استعادة فيروس زيكا المعدي من استنساخ الحمض النووي التكميلي ثنائي البلازميد. تُستخدم هذه التقنية لدراسة علم الفيروسات الصفراء وتطوير اللقاحات واستكشاف آليات العدوى.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويود المؤلفون أن يشكروا كريستين بولارد-فيبلمان وميلينا فيسيلينوفيتش وكلوديا روكيرت على مساعدتهم في وصف الفيروس المستخرج من النسخ المستنسخ. وأيد هذا العمل جزئيا من المنح المقدمة من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية، المعاهد الوطنية للصحة في إطار المنح AI114675 (بجج) و AI067380 (جدي).

<ol><li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika%3A+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).</li>
<li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome--case+report%2C+French+Polynesia%2C+December+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveill. 19 (9), (2014).</li>
<li>Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cryptic+prokaryotic+promoter+within+the+cDNA+encoding+the+5%27+end+of+dengue+virus+RNA+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome.</a> PLoS One. 6 (3), e18197(2011).</li>
<li>Pu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+propagate+flavivirus+infectious+cDNA+clones+in+bacteria+by+introducing+tandem+repeat+sequences+upstream+of+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome.</a> J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).</li>
<li>Pu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+propagation+of+flavivirus+infectious+cDNAs+by+a+novel+method+to+reduce+the+cryptic+bacterial+promoter+activity+of+virus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes.</a> J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).</li>
<li>Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+of+infectious+yellow+fever+RNA+from+full-length+cDNA+templates+produced+by+in+vitro+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation.</a> New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).</li>
<li>Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+reverse+genetics+system+for+Japanese+encephalitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus.</a> J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).</li>
<li>Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+major+determinant+of+mouse+neurovirulence+of+dengue+virus+type+2+using+stably+cloned+genomic-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA.</a> J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).</li>
<li>Johansen, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intron+insertion+facilitates+amplification+of+cloned+virus+cDNA+in+Escherichia+coli+while+biological+activity+is+reestablished+after+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).</li>
<li>Shan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Infectious+cDNA+Clone+of+Zika+Virus+to+Study+Viral+Virulence%2C+Mosquito+Transmission%2C+and+Antiviral+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors.</a> Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).</li>
<li>Schwarz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+1947+Zika+Virus+Prototype+Strain+with+a+Cytomegalovirus+Promoter-Driven+cDNA+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone.</a> mSphere. 1 (5), (2016).</li>
<li>Tsetsarkin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Full-Length+Infectious+cDNA+Clone+of+Zika+Virus+from+the+2015+Epidemic+in+Brazil+as+a+Genetic+Platform+for+Studies+of+Virus-Host+Interactions+and+Vaccine+Development%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li>
<li>Gadea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+method+for+the+rapid+generation+of+recombinant+Zika+virus+expressing+the+GFP+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene.</a> Virology. 497, 157-162 (2016).</li>
<li>Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+an+infectious+dengue+virus+type-2+RNA+genome+%28New+Guinea+C+strain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain).</a> Gene. 162 (2), 175-180 (1995).</li>
<li>Messer, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+reverse+genetic+system+for+studying+dengue+virus+serotype+3+strain+variation+and+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486(2012).</li>
<li>Kinney, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+virulence+and+thermostable+replication+of+the+North+American+strain+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).</li>
<li>Chang, A. C., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+amplifiable+multicopy+DNA+cloning+vehicles+derived+from+the+P15A+cryptic+miniplasmid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid.</a> J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. 91 (1), (2017).</li>
<li>Roberts, P. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+inactivation+by+protein+denaturants+used+in+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography.</a> Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> J Vis Exp. (93), e52065(2014).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. , (2016).</li>
<li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Drift+during+Systemic+Arbovirus+Infection+of+Mosquito+Vectors+Leads+to+Decreased+Relative+Fitness+during+Host+Switching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نصف هنا طريقة لاستعادة نظام استنساخ (كدنا) المعدي ثنائي الأجزاء ل ZIKV. تعاني المستنسخة الموصوفة سابقا ل ZIKV إما من التوهين أو تتطلب إضافة الإنترونات ، مما يجعل البلازميدات أكبر ويمنع الإنقاذ في خلايا الحشرات. يمكن استعادة الفيروس المعدي باستخدام نظام استنساخ ثنائي البلازميد في خلايا الثدييات أو الحشرات (البيانات غير معروضة). بالإضافة إلى ذلك ، يتصرف الفيروس المسترد من هذا النظام بشكل مشابه للفيروس من النوع البري في العديد من خطوط الخلايا ، في نموذج الفئران الضعيف للمناعة وفي البعوض. 
نظرا لو...

فيروس زيكا (زيكف؛ عائلة فلافيفريداي : جنس فلافيفيروس ) هو فيروس منقول بالبعوض الذي وصل إلى البرازيل في 2013-14، وكان مرتبطا بعد ذلك بفاشية واسعة من مرض الحمى التي انتشرت في جميع أنحاء الأمريكتين 1 . وبالإضافة إلى ذلك، تم ربط زيكف مع نتائج المرض الشديد، مثل متلازمة غيلان باريه في البالغين وصغر الرأس في الأجنة والحديثين 2 . ولم يعرف القليل عن زيكف قبل انتشاره السريع في نصف الكرة الغربي. وشمل ذلك نقص الأدوات الجزيئية، مما أعاق البحث الآلي. الأدوات الجزيئية للفيروسات، مثل الحيوانات المستنسخة كدنا المعدية، وتسهيل اللقاح والتنمية العلاجية المضادة للفيروسات، والسماح لتقييم العوامل الوراثية الفيروسية المتعلقة المرضية الفيروسية التفاضلية، والاستجابة المناعية والتطور الفيروسي. ومن المعروف أن الحيوانات المستنسخة عدوى فيروس العوز المناعي البشري غير مستقرة للغاية في البكتيريا بسبب كريبتيك بروكاريوتيك المروجين موجودة في الجينومات الخاصة بهم 3 . وقد استخدمت عدة نهج لتحسين هذه المشكلة؛ بما في ذلك إدخال جنبا إلى جنب يكرر المنبع من تسلسل الفيروسية 4 ، طفرة من المفترضة متواليات بدائيات بدائية النواة 5 ، وتقسيم الجينوم إلى البلازميدات متعددة 6 ، ناقلات عدد النسخ المنخفضة (بما في ذلك الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية) 7 ، 8 وإدخال الإنترونات في الجينوم الفيروسي 9 . وقد وصفت نظام كامل طول دون تعديلات ل زيكف. ومع ذلك، يبدو أن هذا الاستنساخ الموهن في ثقافة الخلايا وفي الفئران 10 . وقد قامت مجموعات أخرى بتصنيع إنترونات في جينوم زيكف، مما يسمح بتعطيل تسلسل غير مستقر في البكتيريا التي يمكن أن تقسم في خلايا الثدييات في المختبر لإنتاج الفيروس المعدية 11، 12 . بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام نظام القائم على ير بعنوان العدوى سوبجينوميك-أمبليكونس بنجاح لإنقاذ سلالة MR766 النموذج من زيكف 13 . إن المنهج الموصوف هنا لا يتطلب أي تسلسل أجنبي، بل يعطل الجينوم في المنطقة من عدم الاستقرار العالي باستخدام البلازميدات المتعددة، والتي سبق استخدامها بنجاح مع الحمى الصفراء 6 ، حمى الضنك 14 ، 15 وفيروسات غرب النيل 16 . وعلاوة على ذلك، إضافة تسلسل ريبوزيمي التهاب الكبد D في تيرميني الجينومي الفيروسي يسهل إنشاء نهاية أصيلة 3 &#39;دون الحاجة إلى إضافة موقع الخطي. بالإضافة إلى ذلك، يتم بناء كلا البلازميدات في ناقلات عدد منخفض نسخة (pACYC177، ~ 15 نسخة لكل خلية) للتخفيف من أي سمية المتبقية 17 . فيروس تعافى يعرض لمحة النمو مماثلة لفيروس الوالدية في منحنيات نمو المختبر في 8 خطوط الخلايا التي تضم مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المستمدة من كل من الثدييات والحشرات، وعرضت ملامح مماثلة المسببة للأمراض في الفئران والعدوى، ونشر ونقل معدلات في البعوض 18 . هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول يصف كيفية زراعة البلازميدات استنساخ المعدية، وتوليد كامل طول الحمض النووي الريبي الفيروسي (الجينوم الفيروسي) في المختبر، واستعادة الفيروس المعدية في ثقافة الخلية. أولا، نحن تصف انتشار البلازميدات في البكتيريا أو خالية من البكتيريا التضخيم باستخدام المتداول دائرة التضخيم (رسيا). بعد ذلك، وتبين لنا كيف يتم هضم البلازميدات اثنين ومن ثم ليغاتد لاحقا معا لتوليد كامل طول الفيروس. وأخيرا، نحن تصف إنتاج الحمض النووي الريبي المنقولة وما يليه إليكتروبوراتيون في خلايا فيرو، تليها المعايرة من فيروس تعافى ( الشكل 1 ). النهج الموصوف هو سريع، مما يسمح فوr استعادة مخزونات الفيروسات المعدية في 1-2 أسابيع.

<table><tbody><tr><td>NEB مستقرة كفاءةE. قولونية</td><td>نيو إنجلاند BioLabs</td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>كاربينيسيلين ، ملح ثنائي الصوديوم</td><td>مختلف</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4036</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4202</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td>20،000 وحدة / مل</td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td>20,000 وحدة / مل</td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10,000 وحدة / مل</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>20,000 وحدة / مل</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3136S</td><td>20,000 وحدة / مل</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td>20,000 وحدة / مل</td></tr><tr><td>illustra TempliPhi 100 طقم تضخيم</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25640010</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel و PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1,000 وحدة / مل</td></tr><tr><td>الفوسفاتيز القلوي ، معوي العجل (CIP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0290S</td><td>10,000 وحدة / مل</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td>400،000 وحدة / مل</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E2065S</td><td></td></tr><tr><td>خلايا Vero</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ECM 630 نظام التثقيب الكهربائي عالي الإنتاجية</td><td>BTX</td><td>45-0423</td><td>الآلات الأخرى مقبولة.</td></tr><tr><td>مرق LB مع أجار (ميلر)</td><td>يمكن أيضا صنع Sigma</td><td>L3147</td><td>.</td></tr><tr><td>مرق رائع</td><td>سيجما</td><td>T0918</td><td>يمكن أن يكون محلي الصنع أيضا.</td></tr>بتري <tr><td>طبق</td><td>Celltreat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب الثقافة</td><td>VWR International</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>قوارير T75</td><td>Celltreat</td><td>229340</td><td></td></tr><tr><td>T182 قوارير</td><td>Celltreat</td><td>229350</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 مع L-glutamine</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM مع L-glutamine و 4.5 جم / لتر جلوكوز</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنينية (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>مسحوق التراجاكانث</td><td>MP Bio</td><td>MP 104792</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Amresco</td><td>0528-1006</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول المشوه</td><td>VWR International</td><td>BDH1156-1LP</td><td></td></tr><tr><td>6 لوحة</td> <td>بئرCelltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12 بئر</td><td>لوحة Celltreat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>تسلسل Oligos</td><td>IDT</td><td>انظر الجدول 1</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Qubit 3.0</td><td>الطرق الأخرى مقبولة.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32850</td><td>طرق أخرى مقبولة.</td></tr><tr><td>كيوبيت RNA HS الفحص كيت</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32852</td><td>الطرق الأخرى مقبولة.</td></tr><tr><td>تختلف خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية</td><td></td><td>N / A</td><td>هذا ضروري لعمل الفيروسات الحية.</td></tr></tbody></table>

إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

استنساخ العدوى [كدنا] تسمح للتلاعب الجيني للفيروس، مما يسهل العمل على اللقاحات، المرضية، النسخ المتماثل، انتقال وتطور الفيروس. نحن هنا وصف بناء استنساخ المعدية لفيروس زيكا (زيكف)، الذي يسبب حاليا تفشي المتفجرات في الأمريكتين. لمنع السمية للبكتيريا التي لوحظت عادة مع البلازميدات المستمدة من فلافيروس، أنشأنا نظام البلازميد اثنين الذي يفصل الجينوم في الجين NS1 وأكثر استقرارا من البنيات كامل طول التي لا يمكن استردادها بنجاح دون الطفرات. بعد الهضم وربط للانضمام إلى شظيتين، يمكن أن تتولد كامل الحمض النووي الريبي الفيروسية طول عن طريق النسخ في المختبر مع T7 رنا البلمرة. بعد إليكتروبوراتيون من الحمض النووي الريبي كتب في الخلايا، تم استرداد الفيروس الذي عرضت مماثلة في حركية النمو المختبر وفي الجسم الحي الفوعة والأنماط الظاهرية العدوى في الفئران والبعوض، على التوالي.

بروتوكول الموصوفة هنا يسمح لاستعادة فيروس زيكا المستمدة المستنسخ استنساخ. التلاعب نظام استنساخ العدوى البلازميد اثنين هو واضح عندما يؤديها مع الرعاية، بالمقارنة مع الإصدارات كاملة الطول التي هي غير مستقرة للغاية (لا تظهر البيانات). بعد الهضم وربط قطعتين متميزة، يتم إنتاج رنا توج باستخدام النسخ في المختبر مع بوليميراز T7 الذي هو إليكتروبوراتد ثم إلى خلايا فيرو ( الشكل 1 ). يمكن رصد تسلسل البلازميد الصحيح باستخد...

يصف هذا البروتوكول انتعاش فيروس زيكا المعدية من استنساخ كدنا المعدية ثنائي البلازميد.

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو استعادة فيروس معدٍ من مستنسخ Z-DNA لفيروس زيكا يتكون من جزأين. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم الفيروسات النخاعية (flavivirology)، مثل استراتيجيات اللقاحات، والنشوء المرضي، والانتقال، وتطور الفيروس. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن النظام المكون من جزأين أكثر استقراراً من طرق التسلسل الكامل.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول فيروس Zika، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة فيروسية أخرى ثبت صعوبة استنساخها بسبب عدم استقرار البلازميد. سيقوم جيمس ويجر، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. ابدأ بإعداد تفاعلات الهضم لكلا البلازميدين اللذين يشفران جينوم فيروس Zika، P1 وP2. قم بهضم 3.3 micrograms من P1 باستخدام ApaL1 وBamH1 High Fidelity بوجود فوسفاتاز كفء في حجم نهائي قدره 100 microliters.بالنسبة لـ P2، يتم هضم 13.3 µg من DNA الخاص بـ P2 باستخدام ApaL1 و EcoR1 High Fidelity في حجم نهائي قدره 100 µL. تُحضن كلا التفاعلين عند 37 °C لمدة 1.2 ساعة. بعد تنقية البلازميدات المهضومة باستخدام طقم تجاري لتنقية الهلام و PCR، يُضاف 30 µL من محلول الاستخلاص المسخن مسبقاً إلى 70 °C إلى العمود ويُحضن لمدة خمس دقائق.بعد تدوير البلازميدات المهضومة والمنقاة في جهاز الطرد المركزي لترسيبها، قم بتحضير تفاعل الربط عن طريق دمج 29 µL من P1 المنقى و 29 µL من P2 المنقى مع منظم تفاعل ربط T4 DNA و T4 DNA ligase في ماء مقطر مرتين للوصول إلى حجم نهائي قدره 100 µL. يتم تحضين تفاعل الربط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد التحضين، قم بتنقية البلازميد المرتبط كما سبق.استخدم هذه المرة 10 µL من درئة الشطف (elution buffer) المسخنة مسبقاً. بعد ذلك، قم بتشغيل البلازميدات غير المهضومة، والبلازميدات المهضومة، وناتج الربط على هلام الأجاروز. يجب أن تؤدي عملية الربط الناجحة إلى ظهور ناتج ربط يبلغ حجمه حوالي 11Kb.بعد التأكد من أن البلازميدات تتحرك وفقاً للوزن الجزيئي الصحيح، قم بإعداد تفاعل نسخ T7 في المختبر باستخدام ثمانية ميكرولتر (8 µL) من تفاعل الربط المُنقّى، ثم يتم التحضين لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية (37 °C). وبعد التحضين، قم بقياس تركيز RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية (UV spectrophotometer). وقبل يوم أو يومين من عملية التثقيب الكهربائي (electroporation)، قم بتحضير قارورة T182 واحدة من خلايا Vero لكل بناء جيني سيتم استعادته.قم بتضمين دورق T182 ليتم استخدامه كضابط محاكاة للتثقيب الكهربائي. عندما تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 70 و80%، قم بتدفئة وسط DMEM الذي يحتوي على 15% FBS و10 millimolar heaps في حمام مائي مسخن إلى 37 degrees celsius. قم بفصل الخلايا عن طريق التريبسين وفقاً للطرق القياسية، ثم اجمع الخلايا والوسط الذي يحتوي على 10% FBS لإبطال مفعول التريبسين.بعد ذلك، يتم إجراء طرد مركزي للخلايا عند 150 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. وبعد غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS، نقوم بتعليق كل كتلة خلوية في RPMI 1640 بالإضافة إلى 10 mM HEPES بتركيز يصل إلى حوالي 0.5 × 10⁷ خلية/ملل. ثم يتم نقل 200 µL من معلق الخلايا إلى أنبوب معقم.بعد ذلك، أضف 20 µL من الماء كعينة ضابطة وهمية أو 20 µL من RNA إلى كل مجموعة من الخلايا. اخلط الخلايا بلطف عن طريق نقر الأنبوب، ثم انقل محتويات الأنبوب إلى كيوفيت تخطيط كهربائي بفجوة قدرها 2 mm. اضبط جهاز التخطيط الكهربائي على 170 V، ومقاومة صفر Ω، و 950 µF.قم بصعق الخلايا مرة واحدة وأضف على الفور 600 µL من الوسط المجهز مسبقاً. أضف الخلايا إلى قارورة زراعة أنسجة T75 تحتوي على 10 mL من الوسط المجهز مسبقاً. أزل أي وسط متبقٍ من الكيوفيت باستخدام القطارة المرفقة مع الكيوفيت.قم برج الدورق لخلط الوسط والخلايا، ثم ضعه في الحاضنة عند 37 degree celsius. في اليوم التالي وكل يوم يليه، افحص حيوية الخلايا حتى يتم ملاحظة موت الخلايا بنسبة 50 إلى 75% مقارنة بعينة التحكم التي خضعت للتثقيب الكهربائي الوهمي. عند ملاحظة موت الخلايا بنسبة 50 إلى 75%، اجمَع السائل الطافي في أنبوب مخروطي، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة تزيد عن 3,000 times G لمدة 10 دقائق عند four degrees celsius لإزالة الحطام الخلوي.بعد عملية الطرد المركزي، انقل السائل الرائق إلى أنبوب جديد وأضف FBS ليصل إلى تركيز نهائي قدره 20%. بالإضافة إلى ذلك، أضف HEPES المعقم بتركيز نهائي 10 millimolar كعامل درء للحفاظ على القدرة العدوائية للفيروس أثناء التجميد. وأخيرًا، امزج الفيروس باستخدام جهاز vortex ثم وزعه في أنابيب ذات أغطية لولبية. يُحفظ الفيروس عند درجة حرارة minus 80 degrees celsius لاستخدامه مستقبلاً.تظهر هذه الصورة التأثير المتماثل لكل من فيروس Zika من النوع البري PRVABC59 والفيروس المشتق من النسخة الجينية المعدية على حركية نمو خط خلايا Vero المستمدة من الرئيسيات غير البشرية. وتوضح هذه الصورة تأثير كلا الفيروسين على خلايا المشيمة البشرية. كما لوحظت حركية نمو مماثلة في خط خلايا C6/36 المشتق من البعوض.يُظهر منحنى البقاء هذا البيانات التي تم الحصول عليها من فئران مستأصلة لمستقبلات إنترفيرون ألفا وبيتا وجاما بعمر أربعة أسابيع، والتي تم تلقيحها بـ 1,000 PFU من PRVABC59 أو الفيروس المشتق من المستنسخ المعدي. تم تشريح بعوض Aedes aegypti بعد 14 يوماً من وجبة دم تحتوي على فيروس Zika. استُخدم مقايسة اللويحات لتقييم العدوى في أجسام البعوض، وفي الأرجل لقياس الانتشار، أو في الإفرازات اللعابية لقياس انتقال الفيروس المعدي.تُعرض المعدلات كنسبة مئوية من إجمالي البعوض الذي تم اختباره. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تسلسل الفيروس بالكامل. كما من المهم تذكر حصاد الفيروس عند وصول نسبة التأثير الممرض للخلايا (CPE) إلى 50 إلى 75% لتقليل دورات تضاعف الفيروس.تعتبر هذه التقنية مهمة للباحثين في مجال علم فيروسات الفلاري فيروس (flavivirology) لاستكشاف اللقاحات، والنشوء المرضي، وتطور الفيروس في فيروس زيكا.

rescue-characterization-recombinant-virus-from-new-world-zika-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

الانقاذ من فيروسات الانفلونزا من الحمض النووي البلازميد هو تقنية أساسية وضرورية التجريبية التي تسمح للباحثين لتوليد فيروسات الانفلونزا المؤتلف لدراسة جوانب متعددة في البيولوجيا من فيروس الانفلونزا ، وإلى أن تستخدم ناقلات المحتملة أو اللقاحات.

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

يوضح هذا الفيديو إجراء لإصابة الخلايا الجذعية العصبية الجنينية البشرية بفيروس زيكا. يمكن استخدام الخلايا المصابة لمزيد من الدراسات.

عدوى فيروس زيكا للخلايا الجذعية العصبية الجنينية

إنقاذ arenaviruses المؤتلف من cDNAs المستنسخة، وهو نهج يشار إلى عكس علم الوراثة، ويسمح للباحثين للتحقيق في دور الجينات الفيروسية منتجات محددة، فضلا عن مساهمة من المجالات الخاصة المختلفة والمخلفات، إلى العديد من الجوانب المختلفة للبيولوجيا الفيروسة الرملية . وعلى نحو مماثل، عكس تقنيات الوراثة في خطوط الخلايا وافقت عليها الهيئة (فيرو) لتطوير لقاح يوفر إمكانيات جديدة لتوليد لقاحات فعالة وآمنة لمكافحة arenaviruses المسببة للأمراض البشرية.

جيل من الفيروسة الرملية المؤتلف استحداث اللقاحات وافقت عليها الهيئة في خلايا فيرو

&lt; p class = 'jove_content'&gt; يرتبط فيروس زيكا (ZIKV) ، وهو أحد مسببات الأمراض الناشئة ، بتشوهات نمو الجنين وصغر الرأس. يعد إنشاء نظام فعال لزراعة الخلايا المعدية أمرا بالغ الأهمية لدراسات تكرار ZIKV وكذلك تطوير اللقاحات والأدوية. في هذه الدراسة ، يتم توضيح ومناقشة العديد من المقايسات الفيروسية المتعلقة ب ZIKV.

زيكا الفيروسات نظام المعدية خلية الثقافة و<em&gt; في المختبر</em&gt; وقائية تأثير الانترفيرونات

هنا يصف لنا طريقة لوضع نموذج لصغر الرأس التي يسببها فيروس زيكا في الماوس. ويشمل هذا البروتوكول أساليب التطعيم intracerebral الجنينية والأطفال حديثي الولادة، ومرحلة الكبار فيروس زيكا.

إنشاء نماذج الماوس للاضطرابات العصبية التي يسببها فيروس Zika استخدام استراتيجيات حقن Intracerebral: الأجنة والأطفال حديثي الولادة والكبار

ويرد وصف بروتوكول لتقييم استجابات محددة مستضد تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد Ifnar1-/- نموذج مورين لعدوى فيروس (زيكف) زكى. هذا الأسلوب هو محوري للتحقيق في آليات حماية الخلايا وإيمونوباثوجينيسيس من اللقاحات زيكف وهو أيضا قيمة لتقييم فعالية.

تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1-/-

يصف لنا طريقة لتقييم أثر الحصانة موجودة مسبقاً ضد فيروس حمى الدنج في عدوى فيروس زيكا باستخدام مصل الدم البشري وخلايا الإنسان الأولية، والكمي العدوى بالكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل.

التحديد الكمي لتعزيز تعتمد على جسم مضاد الفيروس Zika في خلايا الإنسان الأولية

ويبرز وباء فيروس زيكا الذي أُحدث مؤخراً أهمية وضع نُهُج جينية عكسية لتطوير اللقاحات و/أو الاستراتيجيات العلاجية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لإنقاذ فيروس زيكا المؤتلف المعدية من استنساخ cDNA كامل الطول تجميعها في كروموسوم اصطناعي البكتيرية تحت سيطرة الفيروس المضخم للخلايا البشرية المروج الفوري في وقت مبكر.

إنقاذ فيروس زيكا المؤتلف من استنساخ cDNA كروموسوم اصطناعي جرثومي

والهدف من البروتوكول هو إظهار التقنيات المستخدمة للتحقيق في الأمراض الفيروسية عن طريق عزل وقياس فيروس زيكا، من أجهزة متعددة في فأر ة بعد العدوى.

عزل وتقدير كمية لفيروس زيكا من أجهزة متعددة في الماوس

ويمكن للبروتوكول المقدم أن يحدد كفاءة البعوض Aedes aegypti في حالات الإصابة بفيروس معين، مثل زيكا، في بيئة احتواء.

تحليلات كفاءة النواقل على بعوض Aedes aegypti باستخدام فيروس زيكا

في هذا العمل، نصف البروتوكولات المستخدمة في المقايسات القائمة على الإنزيمات القائمة على replicon والفيروسية لفحص مثبطات تكرار فيروس زيكا في شكل فحص عالي الإنتاجية.

عالية الإنتاجية المضادة للفيروسات المقايسات لفحص لمثبطات تكرار فيروس زيكا

تعلم استعادة فيروس زيكا المعدي من استنساخ الحمض النووي التكميلي ثنائي البلازميد. تُستخدم هذه التقنية لدراسة علم الفيروسات الصفراء وتطوير اللقاحات واستكشاف آليات العدوى.

إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى

استكشف المزيد من الفيديوهات