طرق جديدة لدراسة الترميز الذوقي

الهدف العام من هذه الطرق هو دراسة التشفير الذوقي في حيوان بسيط من نوع mandi-casecsta عن طريق تسجيل نشاط الخلايا العصبية المستقبلة المتعددة في الجسم الحي، مع تقديم ومراقبة نبضات من المواد المذاقية الموقوتة بدقة. يمكن لهذه الطرق أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية حول التذوق، مثل كيفية تشفير المذاقات بواسطة مجموعات من الخلايا العصبية المستقبلة للذوق. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بإجراء تسجيلات في الجسم الحي لعدة خلايا عصبية ذوقية قبل وأثناء وبعد تقديم محفزات مذاقية دقيقة.

قد يجد الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة في تطبيقها نظراً لتعقيد إجراءات التشريح. وبسبب ذلك، نأمل أن يكون العرض المرئي للطريقة مفيداً. لقد طوّر Sam Writer هذه التقنيات عندما كان طالباً في مرحلة الدراسات العليا في مختبري، بالتعاون مع Alejandra، وسيقوم Kui Sun باستعراض هذه الإجراءات.

بعد ثلاثة أيام من الخروج من الشرنقة، اختر فراشة من أي من الجنسين تبدو بصحة جيدة بشكل عام. يجب أن تكون الأجنحة ممتدة بالكامل، وأن يكون الخرطوم وقرون الاستشعار مكتملة التكوين وسليمة. داخل خزانة استخلاص الغازات، ضع الفراشة المختارة في أنبوب تقييد حتى يبرز الرأس.

بعد ذلك، قم بتثبيت العثة عن طريق إدخال ورق مناديل في الطرف الآخر من الأنبوب. الآن، وباستخدام هواء مضغوط يتم إطلاقه من حقنة، قم بإزالة الشعر من الرأس المكشوف. ثم، ضع الأنبوب على منصة طينية في طبق بتري.

وجّه الرأس بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى. بعد ذلك، قم بحماية قرني الاستشعار والخرطوم. أولاً، اصنع أغطية لكل بنية من رؤوس ماصات سعة 200 microliter مقصوصة إلى أطوال تبلغ نصف سنتيمتر.

لتحريك الخرطوم، قم بتجهيز خطاف من قطعة سلك. قم بمد الخرطوم داخل أحد الأغطية حتى يتم حماية الجزء الأكثر دنيوية من الخرطوم. ثبّت الأنبوب في الجزء الظهري من كبسولة الرأس باستخدام شمع باتيك متماسك.

بعد ذلك، قم بتغطية قرون الاستشعار بعناية وثبّت الأنابيب باستخدام شمع الباتيك. الآن، قم بتثبيت الدماغ عن طريق قطع عضلة ضاغط الإبزيم. وباستخدام مجهر التشريح، استخدم أدوات التشريح المجهري لفتح كبسولة الرأس عن طريق إجراء قطع صغير أسفل الخرطوم مباشرةً.

للتأكد من قطع العضلة، قدم محلول السكروز إلى الثلثين البعيدين من الخرطوم، وتأكد من عدم تمدده لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أغلق محفظة الرأس باستخدام طبقة من شمع الباتيك المذاب. ولتروية الدماغ بالمحلول الملحي، قم ببناء كوب شمعي حول الجانب البطني للرأس.

باستخدام جهاز تشميع كهربائي، ابدأ في بناء كوب شمعي على طول مقدمة الرأس مع التحرك باتجاه الخلف. أبقِ أنابيب الخرطوم وقرون الاستشعار داخل الكوب. استمر في بناء الكوب للخارج وللأعلى حتى يصل إلى مستوى العينين.

باستخدام الملقط، خذ اللوامس الفمية وثبّتها في الكوب الشمعي باستخدام الشمع المصهور. بعد ذلك، أغلق أي فتحات في الكوب الشمعي والأنابيب باستخدام طبقة رقيقة من إيبوكسي ثنائي المكونات. اخلط الإيبوكسي باستخدام عود أسنان.

أولاً، قم بتغطية السطحين الخارجي والداخلي للكوب. ثانياً، املأ جزء أنبوب التثبيت المحيط بالعنق بحيث يتم تثبيت الرأس بشكل أكثر إحكاماً. وبعد مرور 20 دقيقة، افحص الكوب للتأكد من عدم وجود تسريبات.

لبدء جراحة الدماغ، قم أولاً بقطع الملامس الشفوية. ولفتح الجانب البطني من كبسولة الرأس، اقطع القشيرة على طول الجزء الخلفي والأمامي من الرأس وحول العينين. ثم اقطع على طول الجزء الخلفي من الرأس وقم بإجراء المزيد من القطوع على طول الجزء الأمامي من الرأس بالقرب من الخرطوم.

بعد ذلك، ارفع طبقة الجلد الخارجية برفق باستخدام الملقط لكشف الدماغ. والآن، قم بتنفيذ الخطوة الأكثر أهمية، وهي كشف المنطقة المجاورة للمريء (SEZ) والأعصاب الفكية. قم بإزالة الأنسجة الدهنية والرغامى ببطء وبحذر.

اشطف الدماغ بشكل متكرر بمحلول ملحي طازج. كن حذراً للغاية، حيث من السهل جداً سحق الأعصاب الفكية. عندما تصبح SEZ والأعصاب الفكية مرئية أخيراً، ستكون مغطاة بغمد رقيق.

لإزالة هذا الغمد، قم بتصريف أي محلول ملحي زائد، ثم أضعف الغمد عن طريق تطبيق محلول collagenase dispase بتركيز 10%. بعد النقع لمدة خمس دقائق، اشطف المحلول عدة مرات باستخدام المحلول الملحي. بعد ذلك، وبعد عدة عمليات شطف بالمحلول الملحي، قم بإزالة الغمد برفق باستخدام ملاقط التشريح الدقيق فائقة الدقة.

وأخيرًا، قم بتثبيت خط تقطير ملحي في كوب التروية. يصف هذا القسم كيفية بناء واستخدام نظام توصيل المواد المذاقة. يتكون النظام من أنبوب اختبار به عدة فتحات.

توفر هذه الفتحات مدخلاً لخرطوم الحيوان، ومستقبلات التذوق المتعددة، ومستشعر الألوان، كما أنها تسمح بتدفق المياه. لبناء هذا النظام، قم أولاً بتجهيز أنبوب اختبار للخرطوم. اصنع ثقباً بحجم الخرطوم باستخدام كاوية لحام.

بعد ذلك، قم بإنشاء قسم محاط بشبكة داخل الأنبوب لتثبيت الخرطوم في مكانه. قم بالقص على ارتفاع خمسة مليمترات فوق الفتحة، ثم ضع الشبكة هناك باستخدام الشمع، وأعد توصيل الأنابيب باستخدام الشمع والإيبوكسي. استخدم نظام تروية مضغوط لإيصال المواد المذاقية.

قم بتوصيل العدد المطلوب من أنابيب التذوق بمجمّع. لتوصيل أنبوب مخرج التذوق، اصنع ثقباً على ارتفاع سنتيمتر واحد تقريباً فوق الشبكة، ثم قم بتثبيت أنبوب المخرج فيه باستخدام الإيبوكسي. أضف صبغة اصطناعية إلى كل مادة تذوق ليتم اكتشافها بواسطة مستشعر الألوان.

قم بتثبيت مستشعر ألوان في الجهاز عند فتحة تبعد نصف سنتيمتر تقريبًا عن الشبكة، وثبته هناك باستخدام راتنج الإيبوكسي. استخدم مضخة تمعجية لتوصيل الماء المقطر إلى النظام عبر أنابيب سيليكون. اجمع المياه العادمة في حاوية كبيرة.

استخدم مضخة هوائية لإيصال المواد المذاقية عبر نفثات من الهواء. الآن، ابدأ بضخ مياه نقية عبر الأنابيب، وقم بإيصال نبضات من المادة المذاقية لاختبار مستشعر اللون. الآن، قم بإدخال ثلثي خرطوم العثة في أنبوب الاختبار.

باستخدام الملقط، قم بمد الخرطوم وادفعه برفق داخل الثقب. ثم، قم بتثبيت الخرطوم في مكانه باستخدام شمع الأسنان اللين وطبقة من الإيبوكسي. والآن، قم بتوصيل خط تروية المحلول الملحي وضبط تدفق التروية.

بعد ذلك، اغمر القطب الأرضي للرباعي السلكي المجدول في حمام المحلول الملحي. ثم، باستخدام المجهر الدقيق، ضع الرباعي السلكي بجوار العصب الفكي العلوي، وقم بدفعه ببطء داخل العصب. وبعد اكتشاف إشارات التشنج، اترك التحضير ليستقر لمدة 10 دقائق على الأقل قبل البدء في التسجيلات.

أُجريت التسجيلات من العصبونات المستقبلة للتذوق قبل وأثناء وبعد تقديم المواد المذيقة باستخدام البروتوكول الموصوف. وقد تمت مراقبة بداية ونهاية نبضة مدتها ثانية واحدة من كل مادة مذيقة بواسطة مستشعر الألوان. وقد أدت المواد المذيقة إلى تحفيز جهود فعل (spikes) تم رصدها بواسطة كل قناة من القنوات الأربع.

يمكن ملاحظة جهود الفعل الفردية ضمن قطارات النبضات. وقد استُخدم برنامج فرز النبضات لتخصيص هذه النبضات لعصبونات فريدة. وتكشف استجابة ثلاثة عصبونات مستقبلات تذوق مختلفة لستة مواد تذوق تم تقديمها بالتتابع عن مستويات مختلفة من النشاط القاعدي والانتقائية تجاه مواد التذوق.

علاوة على ذلك، اختلفت الاستجابات من حيث التوقيت؛ فبعضها كان مرتبطاً بمدة التحفيز، بينما استمر بعضها الآخر بعد انتهاء التحفيز. كما أمكن إجراء تسجيلات داخل خلوية من محاور المستقبلات الذوقية باستخدام أقطاب زجاجية دقيقة تقليدية.

كانت التسجيلات داخل الخلوية مشابهة جدًا للاستجابات التي لوحظت باستخدام تقنية التترود الموصوفة، إلا أن تسجيلات التترود كانت أسهل في التنفيذ، وأطول استمرارًا، وأكثر قوة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرًا على كشف الأعصاب الفكية والمنطقة تحت المريء في *Mandiocasecta*، وبناء نظام لإيصال المواد المذاقية مع تحكم زمني دقيق. أثناء تنفيذ هذا البروتوكول، يجب ارتداء قفازات السلامة المختبرية وقناع للوجه لأن القشور المسحوقة الناعمة التي تطرحها *Mandiocasecta* يمكن أن تسبب الحساسية.

بمجرد إتقان هذا الإجراء، يمكن إكماله في غضون ثلاث ساعات ونصف. وبعد تطبيق هذا الإجراء، يمكن أيضًا إجراء تسجيلات متزامنة من مناطق دماغية متعددة للإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيفية تحول استجابات الخلايا العصبية للمستقبلات الذوقية للمواد المذاقة عند نقلها إلى الخلايا العصبية المستهدفة بعد التشابكية.