بيب على رقاقة: دراسة خالية من التسمية من التفاعلات البروتين فسفوانوسيتيد

الهدف العام لمقايسة PIP-on-a-chip هو تقييم تفاعلات غشاء البروتين بطريقة كمية خالية من الملصقات. تفاعلات غشاء البروتين هي قلب العديد من عمليات الخلية ومسببات الأمراض الخاصة بها ، لكن تقنيات دراسة هذه التفاعلات قليلة. تتمثل مزايا هذه التقنية في الحجم البسيط المنخفض ، وعدم وجود متطلبات لوضع العلامات على الترابط أو المستقبلات جنبا إلى جنب مع القدرة على اختبار تفاعلات الغشاء بطريقة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية.

العديد من الأهداف العلاجية للفيروسات هي بروتينات الغشاء ، وغالبا ما يتم إجراء دراسات هذه البروتينات المستهدفة في محلول باستخدام المنظفات. توفر تقنيتنا بديلا أكثر صلة بيولوجيا. بينما سترى أن هذا الاختبار قادر على مراقبة تفاعلات البروتينات مع الأغشية ، إلا أنه في الواقع اختبار متعدد الاستخدامات ويمكن استخدامه لمراقبة غشاء الحديد وغشاء الجزيء الصغير وحتى تفاعلات غشاء الببتيد.

للبدء ، اخلطي بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان أو PDMS prepolymer وعامل المعالجة بنسبة 10: 1 ، في قارب وزن بلاستيكي كبير. قم بإزالة الخليط في فراغ لمدة ساعة مع قوة التفريغ عند 500 تور أو أقل. ضع سيد السيليكون الذي يحتوي على نسخ متكررة متعددة من نفس النمط الدقيق SU8 في قارب وزن بلاستيكي كبير واسكب ديغا PDMS ، ثم قم بمعالجته في فرن جاف عند 60 درجة مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، انزع PDMS برفق من سيد السيليكون باستخدام يديك. حدد حدود كل نمط دقيق في مستطيلات باستخدام مشرط جراحي ومسطرة. بعد ذلك ، قم بتقطيع PDMS إلى كتل ، وقم بعمل 16 ثقبا في طرفي كل قناة صغيرة باستخدام لكمة خزعة ، لعمل ثقوب بقطر 1.0 ملليمتر.

قامت الماصة بحساب أحجام الفوسفاتيديل كولين والفوسفاتيديلينوسيتول 4 و 5-ثنائي الفوسفات ومسبار الفلورسنت الحساس للأس الهيدروجيني في قارورة تهوية زجاجية واحدة سعة 20 ملليلترا. جفف الخليط في تيار من غاز النيتروجين داخل غطاء الدخان الكيميائي لمدة 10 دقائق أو حتى يتبخر المذيب ويتشكل الطبقة الدهنية الرقيقة في قاع القارورة. بعد ذلك ، قم بتجفيف الخليط تحت الفراغ لمدة ثلاث ساعات على الأقل بقوة فراغ تبلغ 10 ميلتر لإزالة أي مذيب عضوي متبقي.

أعد ترطيب طبقة الدهون المجففة بخمسة ملليلتر من المخزن المؤقت الجاري ، ضع الدهون المعاد ترطيبها في حمام بالموجات فوق الصوتية بتردد تشغيل يبلغ 35 كيلو هرتز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتجميد تعليق الحويصلة بإذابة النيتروجين السائل وحمام مائي 40 درجة مئوية للحصول على حويصلات أحادية اللامينار. كرر ذوبان الجليد بالتجميد 10 مرات ، وقم بثق تعليق الحويصلة إلى غشاء بولي كربونات بحافة الجنزير 0.1 ميكرون ، باستخدام آلة بثق الدهون لإثراء الحويصلات أحادية الصفيحة الصغيرة.

كرر البثق 10 مرات. اختبر مداخل ومخارج كتلة PDMS بحثا عن الانسداد عن طريق رش الماء منزوع الأيونات عبر الثقوب باستخدام زجاجة غسيل الماء ، ثم جفف كتلة PDMS بغاز النيتروجين. بعد ذلك ، ضع كتلة PDMS وانزلاق الغطاء الذي تم تنظيفه مسبقا داخل غرفة عينة نظام بلازما الأكسجين.

قم بتعريض كتلة PDMS وانزلاق الغطاء ببلازما الأكسجين لمدة 45 ثانية مع إعدادات الطاقة عند 75 واط ، وسرعة تدفق الأكسجين عند 10 سنتيمترات مكعبة في الدقيقة وقوة الفراغ 200 ملليتور. بعد ذلك ، ضع سطح نمط كتلة PDMS عند ملامسة زلة الغطاء مباشرة بعد معالجة بلازما الأكسجين. اضغط برفق لإزالة أي فقاعات هواء في مواقع الاتصال.

ضع الجهاز على لوح تسخين مستو عند 100 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق لتعزيز الترابط. استخدم منديلا مبللا خاليا من النسالة يحتوي على 100٪ من الإيثانول لإزالة أي جزيئات غبار من أعلى وأسفل الجهاز. بعد ذلك ، قم بلصق الجهاز أعلى شريحة مجهر زجاجي.

نقل 100 ميكرولتر من فوسفاتيديلينوسيتول 4 ، 5-ثنائي الفوسفات الذي يحتوي على حويصلات أحادية الصفيحة صغيرة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.65 مل. اضبط درجة الحموضة في المحلول إلى 3/2 تقريبا عن طريق إضافة 6.4 ميكرولتر من 0.2 حمض الهيدروكلوريك العادي. تقوم الماصة بتعديل 10 ميكرولترات من محلول الحويصلة أحادية الصفقة الصغير في كل قناة من خلال المدخل والضغط من خلال الماصة حتى يصل المحلول إلى المخرج.

افصل الطرف عن الماصة واتركه متصلا بالجهاز. بعد تكرار هذه الخطوة لكل قناة ، احتضان الجهاز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ويجب إجراء حقن الحويصلات في القنوات الدقيقة مباشرة بعد تجميع الجهاز. وفي الوقت نفسه ، قم بقص مجموعات من أنابيب المدخل والمخرج ، باستخدام الملقط ، وقم بتوصيل مجموعة أنابيب المخرج بالجهاز ثم قم بلصق الجهاز على مرحلة المجهر.

اغمر أحد طرفي أنبوب المدخل في 25 مل من المخزن المؤقت الموجود في أنبوب مخروطي الشكل وقم بلصقه للتأكد من تأمين الأنبوب. باستخدام مقبس المختبر ، ضع الأنبوب المخروطي على أرضية أعلى من الجهاز من أجل دفع المحلول عبر القنوات الدقيقة عبر تدفق الجاذبية. لكل أنبوب مدخل ، استخدم حقنة لسحب مليلتر واحد من المخزن المؤقت الجاري من الطرف الحر للأنبوب.

قم بإزالة طرف الماصة من المدخل وأدخل الطرف الحر لأنبوب المدخل في الجهاز. كرر هذه العملية لتوصيل جميع قطع أنابيب المدخل بالجهاز. يساعد المخزن المؤقت المتدفق عبر القنوات على إزالة الحويصلات الزائدة غير الممزقة وتوازن الطبقة الثنائية مع الظروف التجريبية.

بعد ذلك ، افتح برنامج التحكم في المجهر. في اللوحة اليسرى ، انقر فوق علامة التبويب المجهر واختر هدف 10x. انقر فوق مباشر ثم أيقونات صور Alexa 568 على شريط الأدوات ، باستخدام مقابض الضبط الدقيقة والخشنة ، ركز على القنوات الصغيرة.

امسح ضوئيا من خلال الجهاز للتحقق من جودة SLBs والقنوات. ثم ، انقر فوق رمز الصورة المغلقة لمصراع FL على شريط الأدوات ، وانقر فوق علامة التبويب الاستحواذ وتحت التعديلات الأساسية ، حدد وقت التعرض. اضبط وقت التعرض على 200 مللي ثانية.

في اللوحة اليسرى ، انقر فوق الاستحواذ متعدد الأبعاد. ضمن قائمة الفلاتر، حدد القناة الحمراء. ثم انقر فوق قائمة الفاصل الزمني ، واضبط الفاصل الزمني على خمس دقائق ، والمدة على 30 دقيقة وقائمة الفاصل الزمني.

حدد أداة الدائرة أسفل علامة تبويب القياس وارسم دائرة في أي قناة. انقر بزر الماوس الأيمن أثناء تحديد الدائرة واختر خصائص. ضمن علامة تبويب الملف الشخصي ، تحقق من كل T لعرض شدة التألق كدالة للوقت.

تأكد من وصول هذا المنحنى إلى هضبة تشير إلى التوازن قبل الانتقال إلى الخطوة التالية ، قم بخفض المحلول العازل إلى أرضية متساوية مثل الجهاز ، لإيقاف التدفق. افصل كل أنبوب مخرج واحدا تلو الآخر وقم بتطبيق 200 ميكرولتر من كل تخفيف للبروتين في قناة المخرج باستخدام ماصة. لا تمارس أي ضغط ، دع الجاذبية تقوم بالعمل.

افصل الطرف عن الماصة واتركه متصلا بجهاز السوائل الدقيقة. كرر هذه العملية لكل قناة وتأكد من عدم إدخال فقاعات الهواء في القنوات أثناء هذه العملية. بعد ذلك ، قم بخفض أنبوب المدخل إلى الأرض أسفل جهاز الموائع الدقيقة لبدء تدفق البروتين عبر القنوات الدقيقة.

قم بلصق الطرف الحر للأنبوب في حاوية نفايات. قم بتدفق تخفيفات مجال تماثل pleckstrin لمدة 30 دقيقة. في اللوحة اليسرى من البرنامج ، ضمن علامة التبويب الفاصل الزمني ، انقر فوق ابدأ ، لبدء التصوير مرة أخرى.

يظهر هنا عرض تمثيلي ل Phosphatidylinositol 4 ، 5-bisphosphate الذي يحتوي على SLBs داخل القنوات الدقيقة. قبل وبعد إضافة مجال تماثل pleckstrin بالتركيزات المشار إليها. يتم رسم شدة التألق من الخط الممسوح ضوئيا عبر القنوات الدقيقة كدالة للمسافة والبكسل لتجارب ربط الفوسفاتيديل كولين ، فوسفاتيديلينوسيتول 4 ، وفوسفاتيديلينوسيتول 4 ، 5-ثنائي الفوسفات.

بعد ذلك ، يتم تطبيع بيانات الربط من التجارب الفردية ، كدالة لتركيز مجال تماثل الفوسفوليباز C دلتا 1 pleckstrin وتناسب مصطلح متساوي ملزم لاستخراج ثوابت الارتباط الظاهرة. تظهر مقارنة ثوابت الارتباط الظاهرة أن مجال تماثل الفوسفوليباز C Delta 1 pleckstrin يتفاعل مع Phosphatidylinositol 4 ، 5-bisphosphate على وجه التحديد ، كما هو متوقع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صنع حويصلات صغيرة أحادية الصفيحة ، وصنع أجهزة ميكروفيليديك ، وتشكيل طبقات ثنائية دهنية مدعومة داخل هذه الأجهزة الموائع الدقيقة ، مثل تفاعلات ربط غشاء البروتين ، باستخدام هذا الاختبار مع نهج PIP-on-a-chip.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل استعادة التألق بعد التبييض الضوئي من أجل تقييم تأثير ارتباط غشاء البروتين على الانتشار الجانبي للدهون. تمهد هذه التقنية الطريق لدراسة تفاعلات غشاء البروتين مع تجميع الدهون الموجودة في الخلايا بدلا من واحد تلو الآخر ، وبالتالي سيؤثر هذا النهج على نطاق واسع على الكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلية لتفاعلات غشاء البروتين.