تحليل الفجوة تعتمد على تقاطع نقل ميرنا مع المجهر 3D فراب

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في النقل المعتمد على تقاطع الفجوة للحمض النووي الريبي الصغير في خلايا عضلة القلب الحية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة دور الحمض النووي الريبي الصغير لنظام معاملات الإشارة بين الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تصور تبادل تقاطع الفجوة للحمض النووي الريبي الصغير وقياسه كميا في خلايا الحياة ذات الدقة الزمنية المكانية العالية.

بعد عزل خلايا عضلة القلب وفقا لبروتوكول النص ، ضع الخلايا على ستة ألواح بئر بكثافة ثلاثة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل سنتيمتر مربع. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، أضف 0.5 تريبزين إلى الخلايا واحتضن الثقافات لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا.

قم بتعطيل التربزين عن طريق إضافة وسط زراعة الخلايا. بعد عد الخلايا ، قم بالطرد المركزي لها بمعدل 300 مرة جم لمدة 10 دقائق. ثم استخدم المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي لإعادة تعليق الخلايا أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 100 ميكرولتر.

بعد ذلك ، امزج 100 ميكرولتر من تعليق الخلية مع الحمض النووي الريبي الفلوري الصغير في أنبوب وقم بتحميل الخليط في كوفيت التثقيب الكهربائي. ثم قم بإجراء التثقيب الكهربائي باستخدام برنامج G009 على المثقاب الكهربائي. أضف 500 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الدافئ مسبقا وانقل الحجم الكامل لتعليق الخلية إلى بئر من شريحة حجرة سفلية زجاجية بأربعة آبار.

استزراع الخلايا ليوم واحد عند 37 درجة مئوية ، في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. بعد التسخين المسبق لحاضنة المجهر وتشغيل النظام الكونفوكالي ، أدخل شريحة الغرفة في حامل عينة المرحلة. استخدم هدف الزيت 1.4 نانو بوصة وضوء إثارة ليزر 561 نانومتر ، بقوة ليزر منخفضة ، مع نطاق كشف من 570 إلى 680 نانومتر للعثور على مجموعة خلايا عضلة القلب المنقولة.

بعد ذلك ، في مدير الإعداد ، قم بتنشيط أزرار z-stack والسلسلة الزمنية والتبييض والمناطق. بعد ذلك ، لتحديد معلمات frap ، في قائمة وضع الاستحواذ ، اضبط حجم الإطار على 512 × 512 ، وخطوة الخط إلى واحد ووقت المسح الضوئي إلى أقل من ثانية واحدة. في قائمة القنوات ، اضبط إعدادات طاقة الليزر والإزاحة والكسب للحصول على أقصى قدر من التألق من الحد الأدنى من إثارة الليزر ، لتجنب تشبع الشدة.

ثم اضبط حجم الثقب على ميكرومترين. بعد ذلك ، في قائمة المناطق ، حدد أداة رسم روي واستخدم المؤشر لتمييز الخلية المستهدفة والخلية المرجعية ومنطقة الخلفية. إذا لزم الأمر ، حدد عدة خلايا مستهدفة لتبييض الصور.

في قائمة التبييض، اضبط إعدادات تبييض الصورة. بعد ذلك، في قائمة z-stack، حدد حدود اكتساب z-stack، اعتمادا على سمك الخلايا. اضبط عدد طبقات z على 12 tp 15 ، ثم ابدأ تجربة frap وسجل استرداد التألق.

لتحليل البيانات ، قم بإنشاء أقصى قدر من الإسقاط للمكدسات المكتسبة باستخدام برنامج محدد بالمجهر ، والنقر فوق المعالجة ، والإسقاط الأقصى للكثافة ، وتحديد الملف ، وتطبيقه. أخيرا ، انسخ بيانات شدة التألق في جميع النقاط الزمنية من الهدف والخلفية والخلية المرجعية ، في جدول بيانات وقم بإجراء تحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص. كما هو موضح هنا ، هي خلايا عضلة القلب المعزولة بنمط ألفا أكتينين المخطط النموذجي ولويحات كبيرة من connexin43 ، على طول حدود الخلية إلى الخلية.

كانت بعض الخلايا غير عضلية القلب موجودة في الثقافة. كما هو موضح هنا ، من خلال قياس التدفق الخلوي ، تم الوصول إلى كفاءة نقل 45٪. بالإضافة إلى ذلك ، كشف مقال حي ، أن غالبية الخلايا أظهرت قابلية عالية للحياة ، وهو أمر مهم عند تحليل الاتصال الوصفي الفجوة.

لتحليل frap ، يتم اختيار الخلايا المستهدفة داخل مجموعة الخلايا ويتم تبييضها بالصور بقوة ليزر بنسبة 100٪ ، مما يؤدي إلى تقليل مضان الحمض النووي الريبي الصغير في الخلايا المختارة. أظهر التحليل الكمي وتطبيع البيانات المكتسبة متوسط انتعاش بنسبة 20٪ في هذه التجربة ، أدى الضربة القاضية بوساطة siRNA ل connexin43 ، إلى انخفاض التعبير عن البروتين وتثبيط الاتصال الوصلي الفجوة. تم تقليل استعادة التألق بأكثر من 50٪ مما يشير إلى أن كفاءة نقل الحمض النووي الريبي ميرو تعتمد بشدة على اقتران الفجوة الوصلية بين الخلايا.

يوضح هذا الشكل عرضا سطحيا ثلاثي الأبعاد لتجربة frap. بالمقارنة مع الإسقاطات القصوى ، يمكن استخدام الاستحواذ على مكدسات z لإنشاء عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للتحقيق في توطين وحرك الحمض النووي الريبي الصغير داخل الخلايا. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء قياسات frap في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم اختيار الخلايا المستهدفة التي تحتوي على عدد مماثل من الخلايا المجاورة. علاوة على ذلك ، يجب اختيار معلمات التبييض وشروط الحصول على الصور لتجنب التأثيرات السامة للضوء. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الفحص المجهري frap ، من أجل تحديد وتصور حركة الحمض النووي الريبي الصغير داخل المجموعات الخلوية.