قياس واحد من HDAC1 والنشاط HDAC6 في الحلة الخلايا باستخدام أوهبلك--مرض التصلب العصبي المتعدد

الهدف العام من هذه الطريقة هو تحديد الإمكانات المثبطة ل HDAC للمركبات وتحديد الانتقائية تجاه HDAC6 أو HDAC1 في الخلايا باستخدام مقايسة قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال اكتشاف الأدوية مثل تحديد ما إذا كان مثبط HDAC انتقائيا ل HDAC6 على HDACs من الفئة الأولى في الخلايا الحية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتطلب خطوة حضانة واحدة مع الخلايا والمثبطات والركائز الانتقائية من أجل تحديد الفاعلية ضد شكلين إسويين HDAC في وقت واحد.

يمتد تأثير هذه التقنية إلى اكتشاف الأدوية المبكر لمثبطات HDAC الانتقائية لأنها تكتشف ما إذا كانت انتقائية HDAC6 محفوظة في الخلايا الحية ، وتجنب فحوصات أستلة البروتين الذاتية. على الرغم من أن هذه الطريقة تقيم انتقائية مثبطات HDAC في خلايا HeLa ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على خطوط الخلايا الأخرى مثل الخلايا الأولية والخلايا السرطانية الأخرى بما في ذلك العينات السريرية. زراعة خلايا HeLa إلى التقاء 80٪ في قارورة مزرعة الخلايا T75 في الحد الأدنى من الوسائط الأساسية المكملة بمصل البقر الجنيني بنسبة 10٪ والبنسلين G والستربتومايسين.

اغسل الخلايا مرتين بخمسة ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco. ثم استنشق المخزن المؤقت وأضف ملليلتر واحد من كاشف تفكك الخلية. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا.

بعد خمس دقائق ، أضف تسعة ملليلتر من وسط ثقافة MEM إلى الخلايا وأعد تعليق الخلية تماما. انقل الخلايا إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر ثم عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. اضبط كثافة تعليق الخلية إلى 60،000 خلية لكل مليلتر في MEM.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى آبار التحكم والاختبار لثقافة الأنسجة المعقمة ذات القاع المسطح والمعالجة 96 لوحة بئر. ثم أضف 100 ميكرولتر من وسط ثقافة MEM إلى الآبار الفارغة للوحة البئر 96. احتضان صفيحة البئر 96 عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

استنشق وسط آبار لوحة البئر 96. أثناء شفط الوسط ، تجنب فصل الخلايا وإزالتها من البئر. يمكن تحقيق ذلك باستخدام معدل شفط منخفض ووضع أطراف الشفط بعناية في الزاوية السفلية من سطح البئر.

بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من مركبات الاختبار مرتين في MEM إلى آبار الاختبار ، بما في ذلك Trichostatin A و MS275 و Tubastatin A.أضف 25 ميكرولترا من MEM إلى آبار التحكم والآبار الفارغة. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من خليط الركيزة إلى آبار التحكم والاختبار. ثم أضف 25 ميكرولترا من MEM إلى الآبار الفارغة.

احتضان صفيحة 96 بئر عند 37 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. لإجراء تحلل الخلية ، أضف أولا 10 ميكرولترات من ستة أضعاف RIPA المخزن المؤقت المكمل بمثبط البروتياز إلى كل بئر من لوحة البئر 96. أوقف التفاعل بإضافة 160 ميكرولتر من الأسيتونيتريل البارد إلى كل بئر واخلطه عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

ضع الطبق في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 دقائق. أخرج اللوحة من الفريزر وانقل 220 ميكرولترا من محتوى كل بئر إلى صفيحة 96 بئر مخروطية غير معقمة الطرد المركزي اللوحة عند 5 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد الطرد المركزي ، قم بنقل 200 ميكرولتر من المادة الطافية إلى لوحة 96 بئر متوافقة مع نظام UHPLC. بعد ذلك ، أغلق اللوحة بورق لاصق للتسرب حراري قابل للنزع باستخدام مادة مانعة للتسرب من الألواح. قم بإعداد نظام قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء عن طريق ملئه بنظام الطور المتحرك.

ضع لوحة البئر 96 في مدير عينة يحتوي على حامل لوحة. قم بتشغيل العينات وفقا لشروط UHPLC ESI MS/MS الموجودة في النص. لإجراء تحليل البيانات ، قم بدمج مساحة الذروة لكل ركيزة ومنتجها منزوع الأسيتيل مع برنامج تكامل UHPLC المناسب.

لكل ركيزة ، احسب نسبة مساحة الذروة من نزع الأسيتيل إلى الأسيتيل في كل كروماتوجرام. قم بتضمين عينات الاختبار والتحكم. أخيرا ، احسب النسبة المئوية لتثبيط HDAC لكل عينة اختبار وفقا للمعادلة الموجودة في بروتوكول النص.

يتم عرض الكروماتورسم الكروماتوغرامي UHPLC-MS لعينة هنا. يتم الكشف عن القمم المقابلة للركائز المضافة إلى الخلايا وفقا لتحولاتها الجماعية كما هو موضح في الجدول الأول من البروتوكول المكتوب. يتم إزالة MOCPAC بواسطة HDAC1 لتوفير ذروة MOCPAC غير الأسيتيلية.

وبالمثل ، يتم إزالة BATCP بواسطة HDAC6 لتوفير ذروة BATCP منزوعة الأسيتلات. أخيرا ، يوفر MAL ذروة MAL غير الأسيتيلية التي تعكس إزالة الأسيتيل للعديد من HDACs الذاتية بشكل غير محدد. كما هو موضح هنا ، تم إجراء الشكل مع الكروماتوجرام الذي تم الحصول عليه بتركيزات مختلفة من مثبط HDAC Trichostatin A.A تقييم استجابة الجرعة لمثبطات HDAC القياسية.

تم استخدام القيم المتكاملة التي تم الحصول عليها من MOCPAC و dMOCPAC لحساب فاعلية المثبطات القياسية ضد HDAC1. بعد حسابات IC 50 ، أظهر MS275 ، وهو مثبط HDAC انتقائي من الفئة الأولى ، قيم IC 50 أقل ل HDAC1 من Tubastatin A ، وهو مثبط HDAC6 معروف. من ناحية أخرى ، تم استخدام القيم المعزولة من BATCP و dBATCP لحساب فاعلية المعايير مقابل HDAC6.

هذه المرة ، قدم Tubastatin A قيمة IC 50 أقل من MS275 ، مما يؤكد ملف تعريف الانتقائية الإسوية. Trichostatin A هو مثبط قوي وغير انتقائي بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 72 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح بما في ذلك وقت معالجة الخلية وتحليل لوحة البئر 96.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن أوقات الحضانة المشار إليها هنا مخصصة لخلايا HeLa. إذا تم استخدام خط خلية آخر ، فيجب تحسين ذلك. باتباع هذا الإجراء ، يمكن قياس النشاط المثبط الانتقائي ل HDAC للأشكال الإسوية الأخرى طالما توجد ركائز محددة.

لا تنس أن العمل مع المذيبات العضوية والمواد الكيميائية الأخرى يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما ارتداء نظارات الحماية والقفازات ومعطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.