أوديلاي: طريقة على نطاق واسع لالمعلمات المتعددة الكمي للنمو الخميرة
يوليو 3, 2017
نقدم طريقة لقياس النماذج الظاهرية للنمو من خلايا الخميرة الفردية لأنها تنمو إلى مستعمرات على وسائل الإعلام الصلبة باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري وصفت، خلية واحدة مضاعفة تقييم صفائف المعيشة من الخميرة (أوديلاي). ويمكن ملاحظة عدم التجانس السكاني للخلايا المتطابقة وراثيا المتزايد في المستعمرات بشكل مباشر وكمي.
الهدف العام من ODELAY هو قياس الأنماط الظاهرية للنمو للخلايا الفردية التي تنمو في مستعمرات بطريقة عالية الإنتاجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء الدقيقة وعلم الوراثة وبيولوجيا الأنظمة مثل تأثيرات الاضطرابات الجينية والتفاعلات الدوائية على الأنماط الظاهرية للنمو لأي مستعمرة تشكل كائن حي دقيق. الميزة الرئيسية ل ODELAY هي أنه يمكن الباحث من مراقبة وقياس عدم التجانس السكاني بشكل مباشر بين عدد كبير من الأفراد.
قبل تجميع قالب الأجار ، قم بتنظيف قوالب الأكريليك بنسبة 70٪ من الإيثانول وجففها باستخدام الهواء القسري. هناك ثلاث قطع سفلية وقطعتان منتصبتان. لبدء تجميع قالب الأجار ، خذ القطع السفلية الثلاث وقم بتجميعها بحيث تضع القطعتان المتطابقتان شطيرة القطعة الثالثة.
استخدم مشبكين صغيرين لتثبيت القطع الأساسية على كل جانب. ضع القوائم في القالب مع التأكد من وضع منحنى الليزر بشكل صحيح. ضع شريحة زجاجية نظيفة ومجففة على القالب وثبتها في مكانها مع وضع شريحة زجاجية ثانية على الجانب الآخر.
قم بتثبيت التجميع بمشبك رابط أكبر. قم بتثبيت كلتا الشريحتين بمشابك رابطة أكبر مع التأكد من أن كل مشبك رابط علوي على اتصال مع الشريحة الزجاجية المتداخلة مع الأكريليك. قبل ملء القالب المجمع بالأجار المنصهر ، تأكد من إغلاق الحواف عن طريق سحب حوالي 70 ميكرولترا من وسائط الأجار المنصهرة على طول الجانب الداخلي للقالب.
املأ القالب دون حبس فقاعات الهواء بالداخل عن طريق سحب الأجار المنصهر ببطء على طول حافة القالب. بعد ملء القالب ، اتركه يبرد عند حوالي 23 درجة مئوية من درجة الحرارة المحيطة لمدة 40-60 دقيقة. الخطوة التالية هي فصل العفن.
ابدأ بإزالة مشبك الموثق السفلي. ثم قم بإزالة الجزء السفلي من القالب الذي يتكون من ثلاث قطع محصورة. أمسك الشرائح عن طريق ضغطها ثم قم بإزالة مشابك الموثق بعناية.
ضع القالب على حافة الجزء العلوي من المقعد بحيث يكون جانب القالب مع النقطة الزرقاء متجها لأعلى. ضع كلا الإبهام أسفل الأكريليك والأصابع الأولى في الأعلى باتجاه الحافة الداخلية للقالب وادفع ببطء وحذر مع الإبهام مقابل القالب كما لو كنت تقوم بتدوير فاصل القالب حول حافته السفلية. ضع ضغطا ثابتا ولكن متزايدا ببطء.
يجب أن يظهر كسر وفقاعة هواء على طول خط يغطي الزجاج العلوي فاصل القالب. بعد رؤية خط الكسر الأولي ، استمر في الدفع لأعلى بكلا الإبهام واضغط بضغطا مستمرا. يجب أن يبدأ الأجار في الانفصال عن الزجاج.
استمر في تدوير القالب لأعلى. عندما يأتي الزجاج مجانا تماما ، أمسك به وأخرجه تماما من القالب. ثم قم بإزالة قطعة القالب الأخرى باستخدام حركة مماثلة لرفع القطعة مجانا دون تحريك الأجار.
ضع الشرائح في صندوق طرف معقم مع بعض الماء المعقم عالي النقاء في الأسفل. أغلق الصندوق واحفظه على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل لاستخدامه في اليوم التالي. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تحضير السلالات في لوحة بئر 96 كما هو موضح في بروتوكول النص.
استخدام قارئ الألواح لقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر من كل ثقافة. بعد ذلك ، استخدم بروتوكول التخفيف الآلي لتخفيف الثقافات في اللوحة إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر تبلغ 0.1 تقريبا. بمجرد إعداد برنامج التخفيف ، قم بتحميل لوحات التحميل والأنابيب والنصائح على سطح روبوت مناولة السوائل كما هو موضح في تخطيط السطح.
انقر فوق زر التشغيل لتشغيل برنامج التخفيف. حدد العدد الصحيح لأطراف 50 ميكرولتر والعدد الصحيح لأطراف 300 ميكرولتر. عند الانتهاء من التخفيف ، قم بإزالة لوحة التخفيف من الروبوت وزرع اللوحة عند 30 درجة مئوية مع الحفاظ على الرطوبة لمنع جفاف اللوحة لمدة خمس إلى ست ساعات.
قبل حوالي ساعة إلى ساعتين من اكتمال حضانة لوحة الاستزراع ، قم بتشغيل غرف الحضانة للمجهر والسماح لها بالتوازن عند 30 درجة مئوية. قم بتخفيف المزرعة مرة ثانية إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.01 إلى 0.02 باستخدام نفس بروتوكول التخفيف الآلي. قم بتغطية لوحة التخفيف بختم تجميد معدني وصوتي في حمام جليدي لمدة 30 ثانية مع اللوحة التي تطفو في الماء المثلج.
قم بتسمية أربعة ألواح ذات قاع مسطح 96 جيدا على أنها واحدة واثنتين وثلاثة وأربعة. انقل 150 ميكرولترا من كل ثقافة صوتنة من لوحة التخفيف إلى الألواح السفلية المسطحة باتباع هذا النمط. الآبار A1 إلى D6 في الآبار C4 إلى F9 من اللوحة الأولى.
الآبار A7 إلى D12 في الآبار C4 إلى F9 من اللوحة الثانية. الآبار E1 إلى H6 في الآبار C4 إلى F9 من اللوحة الثالثة. والآبار E7 إلى H12 في الآبار C4 إلى F9 من اللوحة الرابعة.
لبدء هذا الإجراء ، ضع شريحة الاغاروز بشكل صحيح في غرفة الشريحة. بعد ذلك ، ضع 96 لوحة ذات قاع مسطح على الطاولة بترتيب ربعها. اللوحات الأولى والثانية والثالثة والرابعة من اليسار إلى اليمين.
ضع النصائح في أربعة صناديق أطراف فارغة بحيث يتم شغل 24 بئرا داخليا لكل صندوق تلميح بالنصائح. في المربع الخامس ، ضع طرفا في الموضع C10 والأطراف مع قطع نهايتها في المواضع A1 و A12 و H1 و H12. ستوفر هذه النصائح الأربعة المقطوعة ثباتا لمشبك لوحة الطرف.
ضع أول لكمة الطرف في موقع بدء برنامج اكتشاف التحكم في الروبوت لإحداث ثقب في الاغاروز لاستخدامه لاحقا لمحاذاة إحداثيات الأصل. ضع اللوحة الأولى على روبوت مناولة السوائل لتحديد الربع الأول. قم بإزالة الغطاء واستمر في برنامج الإكتشاف.
تحقق للتأكد من وجود جميع البقع. أفرغ الأطراف المستخدمة في حاوية الخطر البيولوجي وضع نصائح جديدة على الروبوت. انتظر حوالي 30 ثانية حتى تجف البقع إلى قطرها حوالي ملليمتر واحد ثم تابع البرنامج.
استبدل اللوحة الأولى باللوحة الثانية واستمر في برنامج الإكتشاف. عندما يتم رصد جميع الأرباع الأربعة وتجف البقع ، استبدل غطاء غرفة الانزلاق واقلب الجهاز. ضع شريحة زجاجية على الجانب العلوي من غرفة الشريحة.
قمأولا بتحميل غرفة الشريحة في المجهر. يتم إجراء الفحص المجهري بفاصل زمني عن طريق تشغيل برنامج نصي مصمم خصيصا. انقر فوق الغالق لفتح غالق الضوء المرسل ثم زر التركيز لبدء معدل الكاميرا العالي.
انقر فوق Go Origin"، وحرك المسرح للعثور على علامة الأصل التي تم ثقبها في الأجار ، ثم تحرك قليلا إلى اليمين للتركيز على الخلايا التي تم رصدها في المنطقة E7. ارجع إلى الثقب الأصلي وقم بتوسيطه في مجال الرؤية. اضبط الأصل على هذه القيمة بالضغط على الزر "تعيين". انتقل إلى الموضع H18 وركز باستخدام المسمار السداسي الأقرب إلى هذا الموقع.
ثم انتقل إلى الموضع L7 وركز باستخدام المسمار السداسي الأقرب إلى هذا الموقع. أخيرا ، انتقل إلى الموضع E7 وركز باستخدام المسمار السداسي الأقرب إلى هذا الموقع. تحقق من التركيز البؤري في المنتصف وعند الحواف في النقاط E12 وH12 وL12 لضبط نطاق التركيز البؤري التلقائي إذا كانت قيم التركيز البؤري z كما هو موضح بالقيمة z أكبر من نطاق التركيز البؤري التلقائي أو ناقصه.
اضغط على زر إعادة تعيين "ثم اضغط على ODELAY". اختر الدليل لحفظ البيانات. سيجمع المجهر البيانات لمدة 48 ساعة أو حتى إغلاق البرنامج.
تظهر صور الفاصل الزمني التمثيلية هذه خلايا الخميرة تنمو على وسط صلب مثل ساعة الصفر وثلاث ساعات وست ساعات وتسع ساعات بعد الإكتشاف. تظهر هنا مجموعة بيانات تمثيلية تقارن بين سلالتين من الخميرة بعد معالجة صور الفاصل الزمني. تعكس أوقات المضاعفة المنتظمة نسبيا شريحة الاغاروز المعدة جيدا ، ولكن أوقات التأخير تختلف اختلافا كبيرا بسبب إعدادات التركيز التلقائي غير المثلى.
يتم عرض مجموعة بيانات أكثر اتساقا هنا حيث يبدو أن جميع أوقات المضاعفة تتداخل بشكل جيد وتبدو أوقات التأخير متسقة. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء إعداد ODELAY في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. تتمثل الخطوات الأكثر أهمية لقياسات ODELAY القابلة للتكرار في إعداد الوسائط باستمرار وتجنب تشويه الوسائط ميكانيكيا أثناء فصل الشرائح.
ODELAY هو اختبار حساس للغاية. على سبيل المثال ، يمكنه ملاحظة عيوب النمو في سلالات الخميرة الحساسة لدرجة الحرارة في درجة حرارة الغرفة حيث تتطلب المقايسات المستندة إلى البقعة شائعة الاستخدام زراعة الخميرة عند 37 درجة مئوية للكشف عن عيب في النمو. بينما تم تطوير ODELAY في الخميرة ، فإن الطريقة قابلة للتطبيق على أي كائن حي مكون للمستعمرات بما في ذلك مسببات الأمراض لاستكشاف مجموعة واسعة من الظروف البيئية والوراثية لفهم سلوك الكائنات الحية الدقيقة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء ODELAY لقياس الأنماط الظاهرية للنمو للكائنات الحية الدقيقة وحيدة الخلية التي تشكل مستعمرات على الوسائط الصلبة. لا تنس أن العمل مع الكائنات الحية الدقيقة يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة للكائنات الحية المدروسة.
نظرة عامة
تتيح طريقة ODELAY تحديد كمي لنواتج نمو الخلايا الخميرية الفردية أثناء تطورها إلى مستعمرات على وسط صلب من خلال التصوير المجهري بمرور الوقت. تسهل هذه التقنية ملاحظة وقياس عدم تجانس السكان بين الخلايا المتطابقة وراثيًا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- علم الوراثة
- بيولوجيا النظم
الخلفية
- يمكن أن يؤثر عدم تجانس السكان بشكل كبير على نتائج النمو في مستعمرات الميكروبات.
- فهم نواتج النمو أمر بالغ الأهمية للحصول على رؤى حول التأثيرات الوراثية والبيئية.
- يوفر التصوير المجهري بمرور الوقت عرضًا ديناميكيًا لنمو الخلايا وتفاعلاتها.
- يوفر ODELAY نهجًا عالي الإنتاجية لدراسة الكائنات الحية الدقيقة المكونة للمستعمرات.
غرض الدراسة
- قياس وتحديد كمي لنواتج نمو الخلايا الخميرية الفردية.
- استكشاف تأثيرات الاضطرابات الوراثية على نمو الخلايا.
- دراسة تفاعلات الأدوية وتأثيرها على نمو الكائنات الحية الدقيقة.
الطرق المستخدمة
- تحضير قوالب الأغار لزرعة الخميرة.
- التصوير المجهري بمرور الوقت لملاحظة نمو الخلايا.
- بروتوكولات تخفيف أوتوماتيكية لتوحيد تركيزات الخلايا.
- استخدام روبوتات معالجة السوائل لمعالجة العينات عالية الإنتاجية.
النتائج الرئيسية
- نجاح تجميع واستخدام قوالب الأغار لنمو الخميرة.
- كشف تحديد كمي لنواتج النمو عن عدم تجانس كبير في السكان.
- اثبت القدرة على ملاحظة تأثيرات التفاعلات الوراثية والمخدرات على النمو.
- زادت المنهجية عالية الإنتاجية من الكفاءة في جمع البيانات.
الاستنتاجات
- ODELAY طريقة فعالة لدراسة نواتج نمو الخميرة.
- تعزز التقنية فهم ديناميات السكان الميكروبية.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى الكائنات الحية الدقيقة الأخرى المكونة للمستعمرات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantitative, multi-parameter measurement of microbial growth phenotypes is critical for de-risking genetic target hypotheses and understanding population heterogeneity in early discovery. ODELAY enables high-throughput, time-resolved analysis of individual cell growth, supporting robust target validation and mechanistic insight. This capability strengthens predictive confidence at key inflection points in microbial genetics and functional genomics pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of growth phenotypes across lag, log, and stationary phases for functional target interrogation.
- Reveals population heterogeneity, supporting mechanistic de-risking and genetic pathway clarification.
- Facilitates assessment of genetic and environmental perturbations on microbial fitness.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative growth assays for downstream screening workflows.
- Supports assay reproducibility and standardization through automated sample handling and imaging.
- Generates high-content, time-resolved data suitable for compound or genetic screen readiness.
Translational & Preclinical Research
- Enables modeling of microbial population responses to genetic or environmental changes relevant to disease or industrial settings.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing robust, quantitative phenotypic endpoints.
- Improves risk-adjusted advancement decisions by clarifying biological variability and response thresholds.
Pipeline & Workflow Integration
ODELAY fits within the early discovery to lead identification continuum, providing a scalable platform for hypothesis testing and assay development in microbial systems.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway analysis by quantifying growth responses to genetic or environmental changes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative growth metrics for assay standardization and screening scalability.
- Analytics: Provides multi-parameter, time-resolved measurements enabling statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Aligns phenotypic outputs with preclinical model requirements when studying disease-relevant microorganisms.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, high-throughput platform adaptable to diverse colony-forming microorganisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of growth assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of microbial targets or interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in time-lapse microscopy, microbial genetics, and quantitative data analysis.
- Needs access to automated liquid handling, imaging infrastructure, and robust data storage.
- Demands rigorous cross-team standardization of media preparation and assay setup.
- Adaptable to various colony-forming microorganisms visible by bright field microscopy.
- Critical to avoid mechanical deformation of media and ensure consistent environmental conditions for reproducibility.
