أوديلاي: طريقة على نطاق واسع لالمعلمات المتعددة الكمي للنمو الخميرة

الهدف العام من ODELAY هو قياس الأنماط الظاهرية للنمو للخلايا الفردية التي تنمو في مستعمرات بطريقة عالية الإنتاجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء الدقيقة وعلم الوراثة وبيولوجيا الأنظمة مثل تأثيرات الاضطرابات الجينية والتفاعلات الدوائية على الأنماط الظاهرية للنمو لأي مستعمرة تشكل كائن حي دقيق. الميزة الرئيسية ل ODELAY هي أنه يمكن الباحث من مراقبة وقياس عدم التجانس السكاني بشكل مباشر بين عدد كبير من الأفراد.

قبل تجميع قالب الأجار ، قم بتنظيف قوالب الأكريليك بنسبة 70٪ من الإيثانول وجففها باستخدام الهواء القسري. هناك ثلاث قطع سفلية وقطعتان منتصبتان. لبدء تجميع قالب الأجار ، خذ القطع السفلية الثلاث وقم بتجميعها بحيث تضع القطعتان المتطابقتان شطيرة القطعة الثالثة.

استخدم مشبكين صغيرين لتثبيت القطع الأساسية على كل جانب. ضع القوائم في القالب مع التأكد من وضع منحنى الليزر بشكل صحيح. ضع شريحة زجاجية نظيفة ومجففة على القالب وثبتها في مكانها مع وضع شريحة زجاجية ثانية على الجانب الآخر.

قم بتثبيت التجميع بمشبك رابط أكبر. قم بتثبيت كلتا الشريحتين بمشابك رابطة أكبر مع التأكد من أن كل مشبك رابط علوي على اتصال مع الشريحة الزجاجية المتداخلة مع الأكريليك. قبل ملء القالب المجمع بالأجار المنصهر ، تأكد من إغلاق الحواف عن طريق سحب حوالي 70 ميكرولترا من وسائط الأجار المنصهرة على طول الجانب الداخلي للقالب.

املأ القالب دون حبس فقاعات الهواء بالداخل عن طريق سحب الأجار المنصهر ببطء على طول حافة القالب. بعد ملء القالب ، اتركه يبرد عند حوالي 23 درجة مئوية من درجة الحرارة المحيطة لمدة 40-60 دقيقة. الخطوة التالية هي فصل العفن.

ابدأ بإزالة مشبك الموثق السفلي. ثم قم بإزالة الجزء السفلي من القالب الذي يتكون من ثلاث قطع محصورة. أمسك الشرائح عن طريق ضغطها ثم قم بإزالة مشابك الموثق بعناية.

ضع القالب على حافة الجزء العلوي من المقعد بحيث يكون جانب القالب مع النقطة الزرقاء متجها لأعلى. ضع كلا الإبهام أسفل الأكريليك والأصابع الأولى في الأعلى باتجاه الحافة الداخلية للقالب وادفع ببطء وحذر مع الإبهام مقابل القالب كما لو كنت تقوم بتدوير فاصل القالب حول حافته السفلية. ضع ضغطا ثابتا ولكن متزايدا ببطء.

يجب أن يظهر كسر وفقاعة هواء على طول خط يغطي الزجاج العلوي فاصل القالب. بعد رؤية خط الكسر الأولي ، استمر في الدفع لأعلى بكلا الإبهام واضغط بضغطا مستمرا. يجب أن يبدأ الأجار في الانفصال عن الزجاج.

استمر في تدوير القالب لأعلى. عندما يأتي الزجاج مجانا تماما ، أمسك به وأخرجه تماما من القالب. ثم قم بإزالة قطعة القالب الأخرى باستخدام حركة مماثلة لرفع القطعة مجانا دون تحريك الأجار.

ضع الشرائح في صندوق طرف معقم مع بعض الماء المعقم عالي النقاء في الأسفل. أغلق الصندوق واحفظه على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل لاستخدامه في اليوم التالي. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تحضير السلالات في لوحة بئر 96 كما هو موضح في بروتوكول النص.

استخدام قارئ الألواح لقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر من كل ثقافة. بعد ذلك ، استخدم بروتوكول التخفيف الآلي لتخفيف الثقافات في اللوحة إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر تبلغ 0.1 تقريبا. بمجرد إعداد برنامج التخفيف ، قم بتحميل لوحات التحميل والأنابيب والنصائح على سطح روبوت مناولة السوائل كما هو موضح في تخطيط السطح.

انقر فوق زر التشغيل لتشغيل برنامج التخفيف. حدد العدد الصحيح لأطراف 50 ميكرولتر والعدد الصحيح لأطراف 300 ميكرولتر. عند الانتهاء من التخفيف ، قم بإزالة لوحة التخفيف من الروبوت وزرع اللوحة عند 30 درجة مئوية مع الحفاظ على الرطوبة لمنع جفاف اللوحة لمدة خمس إلى ست ساعات.

قبل حوالي ساعة إلى ساعتين من اكتمال حضانة لوحة الاستزراع ، قم بتشغيل غرف الحضانة للمجهر والسماح لها بالتوازن عند 30 درجة مئوية. قم بتخفيف المزرعة مرة ثانية إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.01 إلى 0.02 باستخدام نفس بروتوكول التخفيف الآلي. قم بتغطية لوحة التخفيف بختم تجميد معدني وصوتي في حمام جليدي لمدة 30 ثانية مع اللوحة التي تطفو في الماء المثلج.

قم بتسمية أربعة ألواح ذات قاع مسطح 96 جيدا على أنها واحدة واثنتين وثلاثة وأربعة. انقل 150 ميكرولترا من كل ثقافة صوتنة من لوحة التخفيف إلى الألواح السفلية المسطحة باتباع هذا النمط. الآبار A1 إلى D6 في الآبار C4 إلى F9 من اللوحة الأولى.

الآبار A7 إلى D12 في الآبار C4 إلى F9 من اللوحة الثانية. الآبار E1 إلى H6 في الآبار C4 إلى F9 من اللوحة الثالثة. والآبار E7 إلى H12 في الآبار C4 إلى F9 من اللوحة الرابعة.

لبدء هذا الإجراء ، ضع شريحة الاغاروز بشكل صحيح في غرفة الشريحة. بعد ذلك ، ضع 96 لوحة ذات قاع مسطح على الطاولة بترتيب ربعها. اللوحات الأولى والثانية والثالثة والرابعة من اليسار إلى اليمين.

ضع النصائح في أربعة صناديق أطراف فارغة بحيث يتم شغل 24 بئرا داخليا لكل صندوق تلميح بالنصائح. في المربع الخامس ، ضع طرفا في الموضع C10 والأطراف مع قطع نهايتها في المواضع A1 و A12 و H1 و H12. ستوفر هذه النصائح الأربعة المقطوعة ثباتا لمشبك لوحة الطرف.

ضع أول لكمة الطرف في موقع بدء برنامج اكتشاف التحكم في الروبوت لإحداث ثقب في الاغاروز لاستخدامه لاحقا لمحاذاة إحداثيات الأصل. ضع اللوحة الأولى على روبوت مناولة السوائل لتحديد الربع الأول. قم بإزالة الغطاء واستمر في برنامج الإكتشاف.

تحقق للتأكد من وجود جميع البقع. أفرغ الأطراف المستخدمة في حاوية الخطر البيولوجي وضع نصائح جديدة على الروبوت. انتظر حوالي 30 ثانية حتى تجف البقع إلى قطرها حوالي ملليمتر واحد ثم تابع البرنامج.

استبدل اللوحة الأولى باللوحة الثانية واستمر في برنامج الإكتشاف. عندما يتم رصد جميع الأرباع الأربعة وتجف البقع ، استبدل غطاء غرفة الانزلاق واقلب الجهاز. ضع شريحة زجاجية على الجانب العلوي من غرفة الشريحة.

أولا بتحميل غرفة الشريحة في المجهر. يتم إجراء الفحص المجهري بفاصل زمني عن طريق تشغيل برنامج نصي مصمم خصيصا. انقر فوق الغالق لفتح غالق الضوء المرسل ثم زر التركيز لبدء معدل الكاميرا العالي.

انقر فوق Go Origin"، وحرك المسرح للعثور على علامة الأصل التي تم ثقبها في الأجار ، ثم تحرك قليلا إلى اليمين للتركيز على الخلايا التي تم رصدها في المنطقة E7. ارجع إلى الثقب الأصلي وقم بتوسيطه في مجال الرؤية. اضبط الأصل على هذه القيمة بالضغط على الزر "تعيين". انتقل إلى الموضع H18 وركز باستخدام المسمار السداسي الأقرب إلى هذا الموقع.

ثم انتقل إلى الموضع L7 وركز باستخدام المسمار السداسي الأقرب إلى هذا الموقع. أخيرا ، انتقل إلى الموضع E7 وركز باستخدام المسمار السداسي الأقرب إلى هذا الموقع. تحقق من التركيز البؤري في المنتصف وعند الحواف في النقاط E12 وH12 وL12 لضبط نطاق التركيز البؤري التلقائي إذا كانت قيم التركيز البؤري z كما هو موضح بالقيمة z أكبر من نطاق التركيز البؤري التلقائي أو ناقصه.

اضغط على زر إعادة تعيين "ثم اضغط على ODELAY". اختر الدليل لحفظ البيانات. سيجمع المجهر البيانات لمدة 48 ساعة أو حتى إغلاق البرنامج.

تظهر صور الفاصل الزمني التمثيلية هذه خلايا الخميرة تنمو على وسط صلب مثل ساعة الصفر وثلاث ساعات وست ساعات وتسع ساعات بعد الإكتشاف. تظهر هنا مجموعة بيانات تمثيلية تقارن بين سلالتين من الخميرة بعد معالجة صور الفاصل الزمني. تعكس أوقات المضاعفة المنتظمة نسبيا شريحة الاغاروز المعدة جيدا ، ولكن أوقات التأخير تختلف اختلافا كبيرا بسبب إعدادات التركيز التلقائي غير المثلى.

يتم عرض مجموعة بيانات أكثر اتساقا هنا حيث يبدو أن جميع أوقات المضاعفة تتداخل بشكل جيد وتبدو أوقات التأخير متسقة. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء إعداد ODELAY في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. تتمثل الخطوات الأكثر أهمية لقياسات ODELAY القابلة للتكرار في إعداد الوسائط باستمرار وتجنب تشويه الوسائط ميكانيكيا أثناء فصل الشرائح.

ODELAY هو اختبار حساس للغاية. على سبيل المثال ، يمكنه ملاحظة عيوب النمو في سلالات الخميرة الحساسة لدرجة الحرارة في درجة حرارة الغرفة حيث تتطلب المقايسات المستندة إلى البقعة شائعة الاستخدام زراعة الخميرة عند 37 درجة مئوية للكشف عن عيب في النمو. بينما تم تطوير ODELAY في الخميرة ، فإن الطريقة قابلة للتطبيق على أي كائن حي مكون للمستعمرات بما في ذلك مسببات الأمراض لاستكشاف مجموعة واسعة من الظروف البيئية والوراثية لفهم سلوك الكائنات الحية الدقيقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء ODELAY لقياس الأنماط الظاهرية للنمو للكائنات الحية الدقيقة وحيدة الخلية التي تشكل مستعمرات على الوسائط الصلبة. لا تنس أن العمل مع الكائنات الحية الدقيقة يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة للكائنات الحية المدروسة.