أوديلاي: طريقة على نطاق واسع لالمعلمات المتعددة الكمي للنمو الخميرة

الهدف العام من تقنية ODELAY هو قياس الأنماط الظاهرية للنمو للخلايا الفردية التي تنمو لتشكل مستعمرات بطريقة عالية الإنتاجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في علم الأحياء الدقيقة، وعلم الوراثة، وبيولوجيا الأنظمة، مثل تأثيرات الاضطرابات الجينية والتفاعلات الدوائية على الأنماط الظاهرية لنمو أي كائن مجهري مكون للمستعمرات. الميزة الرئيسية لتقنية ODELAY هي أنها تمكن الباحث من المراقبة المباشرة والقياس الكمي للتغاير السكاني بين عدد كبير من الأفراد.

قبل تجميع قالب الآجار، نظف القوالب الأكريليكية باستخدام 70% ethanol وجففها باستخدام الهواء المضغوط. يتكون القالب من ثلاث قطع سفلية وقطعتين رأسيين. لبدء تجميع قالب الآجار، خذ القطع السفلية الثلاث وقم بتجميعها بحيث تحصر القطعتان المتطابقتان القطعة الثالثة بينهما.

استخدم مشبكي ورق صغيرين لتثبيت قطع القاعدة على كل جانب. ضع القوائم الرأسية في القالب مع التأكد من وضع المنحنى الليزري بشكل صحيح. ضع شريحة زجاجية نظيفة ومجففة على القالب وثبتها في مكانها أثناء وضع شريحة زجاجية ثانية على الجانب الآخر.

ثبّت المجموعة باستخدام مشبك ورق كبير. ثبّت كلا الشريحتين بمشابك ورق كبيرة، مع التأكد من أن كل مشبك علوي يلامس الشريحة الزجاجية ويتداخل مع الأكريليك. وقبل ملء القالب المجمّع بالأجار المصهور، تأكد من إحكام غلق الحواف عن طريق سحب حوالي 70 µL من وسط الأجار المصهور ووضعه على طول الجانب الداخلي للقالب.

املأ القالب دون حبس فقاعات هوائية بداخله عن طريق سحب الآجار المنصهر ببطء باستخدام الماصة على طول حافة القالب. بعد ملء القالب، اتركه يبرد في درجة حرارة محيطة تبلغ حوالي 23 درجة Celsius لمدة تتراوح بين 40-60 دقيقة. الخطوة التالية هي فصل القالب.

ابدأ بإزالة مشبك التثبيت السفلي. ثم قم بإزالة الجزء السفلي من القالب المكون من ثلاث قطع متراصة. أمسك الشرائح عن طريق ضغطها، ثم قم بإزالة مشابك التثبيت بعناية.

ضع القالب على حافة سطح المختبر بحيث يكون جانب القالب الذي يحتوي على النقطة الزرقاء متجهًا للأعلى. ضع كلا الإبهامين أسفل الأكريليك والسبابتين في الأعلى باتجاه الحافة الداخلية للقالب، ثم ادفع للأعلى ببطء وحذر باستخدام الإبهامين مقابل القالب كما لو كنت تقوم بتدوير فاصل القالب حول حافته السفلية. طبق ضغطًا مستمرًا ولكن متزايدًا ببطء.

يجب أن يظهر شرخ وفقاعة هواء على طول الخط الذي يغطي فيه الزجاج العلوي فاصل القالب. بعد رؤية خط الشرخ الأولي، استمر في الدفع للأعلى باستخدام كلا الإبهامين مع تطبيق ضغط ثابت. سيبدأ الآجار في الانفصال عن الزجاج.

استمر في تدوير القالب إلى الأعلى. وبمجرد تحرر الزجاج تماماً، أمسكه وأخرجه بالكامل من القالب. ثم قم بإزالة قطعة القالب الأخرى باستخدام حركة مماثلة لرفع القطعة وتحريرها دون تحريك الآجار.

ضع الشرائح في صندوق رؤوس ماصات معقم يحتوي على القليل من الماء المعقم عالي النقاوة في القاع. أغلق الصندوق واحفظه في درجة حرارة 4 درجة مئوية طوال الليل لاستخدامه في اليوم التالي. ابدأ هذا الإجراء بتحضير السلالات في طبق ذو 96 بئراً كما هو موضح في البروتوكول النصي.

استخدم قارئ الأطباق لقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر لكل مزرعة. بعد ذلك، استخدم بروتوكول تخفيف آلي لتخفيف المزارع في الطبق لتصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى 0.1 تقريباً. بمجرد إعداد برنامج التخفيف، قم بتحميل الأطباق والأنابيب والرؤوس على منصة روبوت مناولة السوائل كما هو موضح في مخطط توزيع المنصة.

انقر على زر التشغيل لتشغيل برنامج التخفيف. اختر العدد الصحيح من رؤوس الماصات سعة 50 µL والعدد الصحيح من رؤوس الماصات سعة 300 µL. عند انتهاء عملية التخفيف، قم بإزالة لوحة التخفيف من الروبوت وزرع اللوحة عند درجة حرارة 30 °C مع الحفاظ على الرطوبة لمنع جفاف اللوحة لمدة تتراوح من خمس إلى ست ساعات.

قبل ساعة إلى ساعتين تقريباً من اكتمال حضن طبق المزرعة، قم بتشغيل غرف الحضن الخاصة بالمجهر واتركها لتصل إلى درجة حرارة توازن تبلغ 30 درجة Celsius. قم بتخفيف المزرعة مرة ثانية لتصل الكثافة الضوئية عند 600 nanometers إلى 0.01 إلى 0.02 باستخدام نفس بروتوكول التخفيف الآلي. غطِّ طبق التخفيف بختم تجميد معدني وقم بمعالجته بالموجات فوق الصوتية في حمام ثلجي لمدة 30 ثانية مع ترك الطبق طافياً في الماء المثلج.

قم بتسمية أربعة أطباق ذات قاع مسطح تحتوي على 96 بئرًا بالأرقام واحد، واثنين، وثلاثة، وأربعة. انقل 150 µL من كل مزرعة خضعت للمعالجة بالموجات فوق الصوتية من طبق التخفيف إلى الأطباق ذات القاع المسطح وفقًا لهذا النمط: الآبار من A1 إلى D6 إلى الآبار من C4 إلى F9 في الطبق رقم واحد.

نقل الآبار من A7 إلى D12 إلى الآبار من C4 إلى F9 في اللوحة الثانية. والآبار من E1 إلى H6 إلى الآبار من C4 إلى F9 في اللوحة الثالثة. والآبار من E7 إلى H12 إلى الآبار من C4 إلى F9 في اللوحة الرابعة.

لبدء هذا الإجراء، ضع شريحة الأجاروز بشكل صحيح في حجرة الشرائح. بعد ذلك، ضع أطباق ذات القاع المسطح المكونة من 96 بئراً على الطاولة وفقاً لترتيب ربعها؛ الأطباق واحد، واثنين، وثلاثة، وأربعة من اليسار إلى اليمين.

وزع الرؤوس في أربعة صناديق رؤوس فارغة بحيث يتم ملء الـ 24 بئراً الداخلية من كل صندوق بالرؤوس. وفي صندوق خامس، ضع رأساً في الموضع C10 ورؤوساً مقطوعة الطرف في المواضع A1 وA12 وH1 وH12. ستعمل هذه الرؤوس الأربعة المقطوعة على توفير الاستقرار لمشبك لوحة الرؤوس.

ضع رأس السن pertama في موقع البدء الخاص ببرنامج تنقيط التحكم في الروبوت لثقب ثقب في الآجاروز ليتم استخدامه لاحقاً لمحاذاة إحداثيات الأصل. ضع اللوحة الأولى (Plate One) على روبوت مناولة السوائل لتنقيط الربع الأول. قم بإزالة الغطاء وتابع برنامج التنقيط.

تحقق من وجود جميع البقع. قم بتفريغ الرؤوس المستخدمة في حاوية النفايات البيولوجية الخطرة وضع رؤوساً جديدة على الروبوت. انتظر لمدة 30 ثانية تقريباً حتى تجف البقع لتصل إلى قطر يبلغ حوالي واحد مليمتر، ثم تابع البرنامج.

استبدل اللوحة الأولى باللوحة الثانية وتابع برنامج التنقيط. عندما يتم تنقيط الأرباع الأربعة جميعاً وتجف النقاط، أعد غطاء حجرة الشريحة واقلب الجهاز. ضع شريحة زجاجية على الجانب العلوي من حجرة الشريحة.

أولاً، قم بتحميل حجرة الشريحة في المجهر. يتم إجراء المجهر بنظام الفاصل الزمني (Time lapse microscopy) عن طريق تشغيل نص برمجي مصمم خصيصاً لهذا الغرض. انقر فوق الغالق لفتح غالق الضوء النافذ، ثم انقر فوق زر التركيز لبدء معدل الالتقاط العالي للكاميرا.

انقر فوق "Go Origin" وحرك المسرح للعثور على علامة الأصل التي تم ثقبها في الآجار، ثم تحرك قليلاً إلى اليمين للتركيز على الخلايا الموجودة في المنطقة E7. عد إلى ثقب الأصل وقم بتوسيطه في مجال الرؤية. قم بتعيين الأصل على هذه القيمة بالضغط على زر "Set". انتقل إلى الموضع H18 وقم بالتركيز باستخدام برغي السداسي الأقرب إلى ذلك الموقع.

انتقل بعد ذلك إلى الموضع L7 وقم بضبط التركيز باستخدام برغي سداسي الرأس الأقرب إلى ذلك الموقع. وأخيراً، انتقل إلى الموضع E7 وقم بضبط التركيز باستخدام برغي سداسي الرأس الأقرب إلى ذلك الموقع. تحقق من التركيز في المركز وعند الحواف في النقاط E12 وH12 وL12، وقم بتعديل نطاق التركيز التلقائي إذا كانت قيم z للتركيز، كما هو موضح في قيمة z، أكبر من موجب أو سالب نطاق التركيز التلقائي.

اضغط على زر "Reset" ثم اضغط على "ODELAY". اختر الدليل لحفظ البيانات. سيقوم المجهر بجمع البيانات لمدة 48 ساعة أو حتى يتم إغلاق البرنامج.

تظهر هذه الصور التمثيلية بفاصل زمني نمو خلايا الخميرة على وسط صلب عند الساعة صفر، وبعد ثلاث ساعات، وست ساعات، وتسع ساعات من عملية التلقيح. تظهر هنا مجموعة بيانات تمثيلية تقارن بين سلالتين من الخميرة بعد معالجة الصور المأخوذة بفاصل زمني. تعكس أوقات التضاعف الموحدة نسبيًا جودة تحضير شريحة الآغاروز، ومع ذلك، تتباين أوقات الركود بشكل كبير بسبب إعدادات التركيز التلقائي غير المثالية.

تظهر هنا مجموعة بيانات أكثر اتساقاً، حيث يبدو أن جميع أوقات التضاعف تتداخل بشكل جيد، كما تظهر أوقات الركود متسقة. وبمجرد إتقان الطريقة، يمكن إتمام إعداد ODELAY في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم تنفيذ ذلك بشكل صحيح. وتتمثل الخطوات الأكثر أهمية لضمان تكرارية قياسات ODELAY في تحضير الأوساط الغذائية بشكل متسق، وتجنب التشويه الميكانيكي للأوساط أثناء فصل الشرائح.

يعتبر ODELAY مقايسة عالية الحساسية؛ فعلى سبيل المثال، يمكنها رصد عيوب النمو في سلالات الخميرة الحساسة للحرارة في درجة حرارة الغرفة، بينما تتطلب المقايسات الشائعة القائمة على البقع استزراع الخميرة عند 37 درجة مئوية لإظهار عيب النمو. وعلى الرغم من تطوير ODELAY في الخميرة، إلا أن هذه الطريقة قابلة للتطبيق على أي كائن حي مكون للمستعمرات، بما في ذلك المسببات المرضية، لاستكشاف نطاق واسع من الظروف البيئية والوراثية لفهم سلوك الكائنات الدقيقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء ODELAY لقياس الأنماط الظاهرية للنمو للكائنات الحية الدقيقة وحيدة الخلية التي تشكل مستعمرات على الأوساط الصلبة. لا تنسَ أن العمل مع الكائنات الحية الدقيقة قد يكون خطيراً، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة للكائنات المدروسة.