الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر من الخلايا العصبية المهاجرة في شريحة عضوي نمط ثقافة الفأر الجنينية باستخدام الدماغ في أوتيرو إليكتروبوراتيون

يوفر هذا البروتوكول تعليمات للمراقبة المباشرة من الخلايا العصبية القشرية هجرة شعاعيا. في إليكتروبوراتيون الرحم ، يتم دمج ثقافة شريحة عضوي النمط، والوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر لدراسة مباشرة وديناميكية آثار أوفيركسريسيون أو دونريغولاتيون من الجينات التي تهم في الخلايا العصبية المهاجرة وتحليل التمايز أثناء التنمية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو المراقبة المباشرة للخلايا العصبية المهاجرة شعاعيا في ثقافة الشرائح العضوية المحضرة من الدماغ الجنيني الكهربائي بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر بفاصل زمني. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في دراسة الجوانب الرئيسية لتطور القشرة المخية الحديثة. يسمح بالتحقيق في الآليات الجزيئية المشاركة في استقطاب الخلايا العصبية والهجرة الشعاعية للخلايا العصبية إلى موضعها النهائي داخل الدماغ.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الخصائص الديناميكية للخلايا العصبية المهاجرة التي يمكن تحليلها بما في ذلك ملامح السرعة ومتوسط سرعة الهجرة وكذلك التغيرات في اتجاه الهجرة. ابدأ بوضع فأر حامل مخدر بشكل صحيح في وضع ضعيف على طبق تسخين. تحقق من عدم وجود منعكس الدواسة.

وبعد ذلك ، قم بتغطية العينين بعناية بالفازلين لمنعهما من الجفاف. بعد ذلك ، انشر الأطراف برفق وقم بتثبيتها على لوحة الاحترار بشريط جراحي. تعقيم البطن عن طريق المسح بمحلول 70٪ من الإيثانول متبوعا بمحلول اليود ، ثم ضع شاشا معقما ، حيث تم إجراء قطع لشق البطن ، فوق البطن.

بلل الشاش بمحلول كلوريد الصوديوم المضاد للجراثيم. بعد إعادة تقييم تطور التخدير الجراحي ، عن طريق فقدان منعكس الدواسة ، استخدم ملقط Adson الصغير المسنن والمقص الدقيق بزاوية لقطع الجلد حوالي 1.5 سم على طول خط الوسط للبطن. ثم قم بقطع العضلة الأساسية على طول الخط ألبا.

أمسك قرن الرحم بين الأجنة بالملقط الدائري وضعه برفق على الشاش المبلل دون إزعاج المشيمة أو أوعية الإمداد. بعد ذلك ، ضع الجنين بعناية لإعطاء رؤية واضحة للبطين الجانبي الذي يظهر كظل على شكل هلال مواز للجيب السهمي. يقع موقع الحقن في منتصف خط بين العين المصطبغة والتقاء الجيوب الأنفية حيث يتفرع الجيوب السهمية إلى اثنين من الجيوب الأنفية الانتقالية.

بمجرد تحديدها، ادفع إبرة الحقن المجهري عبر جدار الرحم إلى البطين الجانبي. بعد ذلك ، استخدم حاقن دقيق يعمل بدواسة قدم لحقن ميكرولتر إلى ميكرولتر من محلول الحمض النووي بخمسة إلى 10 نبضات. يمكن مراقبة الحقن الناجح بواسطة محلول الحمض النووي الملون الذي يجب أن يملأ الجهاز البطيني.

بعد ذلك ، ضع أقطاب كهربائية من نوع الملقط بحيث يكون الطرف الموجب على نفس جانب البطين المحقون ويكون الطرف السالب على الجانب الآخر من البطين المحقون أسفل أذن رأس الجنين. بلل موقع التثقيب الكهربائي ببضع قطرات من محلول كلوريد الصوديوم المضاد للجراثيم وقم بتطبيق خمس نبضات تيار كهربائي مدتها 50 مللي ثانية بفواصل زمنية 950 مللي ثانية. تشير الفقاعات الموجودة في القطب السالب إلى التيار الكهربائي.

عادة ما تكون 60 إلى 90 مللي أمبير كافية للتثقيب الكهربائي الناجح. لن تقوم التيارات المنخفضة بنقل الخلايا العصبية بكفاءة بينما قد تؤدي التيارات الأعلى إلى الموت الجنيني. بعد تكرار الإجراء لكل جنين في قرن الرحم الأول ، ضعه برفق مرة أخرى في تجويف البطن.

بعد خياطة طبقة العضلات والجلد ، قم بتطهير بعناية بمحلول اليود وإزالة الفازلين برفق من العينين باستخدام مسحات السليلوز. ضع الماوس تحت مصباح الأشعة تحت الحمراء حتى يستيقظ. بعد القتل الرحيم للأنثى الحامل باستخدام طريقة معتمدة ، قم بإزالة الرحم الذي يحتوي على الأجنة ووضعه في طبق بتري بطول 10 سم مع HBSS البارد المثلج.

من هذه النقطة فصاعدا ، احتفظ بجميع المحاليل والأجنة والأدمغة على الجليد. أثناء العمل تحت المجهر المجسم ، استخدم ملقطا رفيع الرؤوس وزوجا من مقص Vannas Tubingen الزنبكي لفصل كل جنين عن الرحم. نقل الأجنة إلى طبق بتري آخر يحتوي على HBSS كامل مثلج بارد.

قم بعمل شق على مستوى جذع الدماغ وقطع على طول خط الوسط السهمي. قشر الجلد والغضاريف التي تغطي الدماغ. ثم اقطع جذع الدماغ خلف نصفي الكرة الأرضية مباشرة وأزل الدماغ من الجمجمة.

انقل الدماغ بملعقة صغيرة إلى طبق مكون من 12 بئرا يحتوي على HBSS كامل مثلج. اجمع كل الأدمغة من القمامة في اللوحة المكونة من 12 بئرا. بعد ذلك ، استخدم المجهر المجسم الفلوري لفحص الأدمغة في الصفيحة المكونة من 12 بئرا بحثا عن سطوع الإزهار بالإضافة إلى حجم المنطقة المثقبة بالكهرباء.

حدد دماغين إلى أربعة أدمغة بإشارات فلورية ساطعة والقشرة الحسية الجسدية المفترضة لمزيد من المعالجة. بعد ذلك ، صب محلول الاغاروز المنصهر بنسبة 3٪ منخفض نقطة الانصهار في قالب تضمين يمكن التخلص منه. استخدم ملعقة صغيرة لإزالة الدماغ من اللوحة المكونة من 12 بئرا وتصريف HBSS الكامل الزائد بعناية من جميع أنحاء الدماغ باستخدام المناديل الورقية الدقيقة.

ضع الدماغ برفق في محلول الاغاروز. بعد ذلك ، استخدم إبرة قياس 20 لدفعها إلى أسفل القالب وضبط موضعها بعناية. بالنسبة للأقسام الإكليلية ، قم بتوجيه الدماغ مع توجيه البصيلات الشمية لأعلى.

احتفظ بالقالب على الجليد حتى يتجمد محلول الاغاروز ثم انتقل إلى تقسيم الدماغ. استخدم شفرة حلاقة نظيفة لتقليم الاغاروز الزائد حول الدماغ ، مع ترك ما يقرب من ملليمتر واحد من الاغاروز من جميع الجوانب باستثناء البصيلات الشمية حيث يجب ترك ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات من الاغاروز. بعد وضع كمية صغيرة من غراء سيانواكريليت على عينة ، قم بإصلاح كتلة الاغاروز المشذبة مع توجيه المصابيح الشمية لأسفل.

انقل مرحلة العينة إلى غرفة التقطيع الخاصة بميكروتوم شفرة اهتزازية يحتوي على HBSS كامل مثلج بارد وضع الدماغ بجانبه الظهري باتجاه الشفرة. قطع شرائح دماغ بسمك 250 ميكرون تحتوي على المنطقة المثقبة بالكهرباء بسعة منخفضة إلى معتدلة وسرعة تقسيم بطيئة جدا. عادة ما يتم الحصول على أربع إلى ست شرائح بإشارة فلورية ساطعة من كل دماغ كهربائي بنجاح.

أمسك حافة الاغاروز لقسم واحد بملقط ناعم الرؤوس واسحب الشريحة على ملعقة صغيرة مثنية. بهذه الطريقة ، انقل شرائح الدماغ بعناية إلى صفيحة من ستة آبار تحتوي على HBSS كامل مثلج. قم بترطيب إدخالات الغشاء المطلية باللون اللامينين ب 100 ميكرولتر من HBSS الكامل.

بعد ذلك ، انقل الشرائح بعناية إلى الأغشية باستخدام ملعقة الملعقة الصغيرة المنحنية والملقط. ادفع الشريحة برفق من الملعقة إلى الغشاء ، ثم ضعها باستخدام الملقط. استمر في نقل الشرائح المتبقية.

يمكن وضع ما يصل إلى خمس شرائح على غشاء واحد. قم بإزالة HBSS الكامل الزائد باستخدام ماصة. بعد ذلك ، بمساعدة الملقط ، ضع بعناية إدخالات الغشاء مع الشرائح في صفيحة من ستة آبار تحتوي على 1.8 مل من وسط الثقافة المقطع.

حدد شريحة دماغية للتصوير من خلال عرض الشرائح من خلال مجهر مقلوب. اختر شريحة بها خلايا عصبية مفردة ساطعة في SVZ العلوي تهاجر شعاعيا نحو سطح كومة الشريحة. يشير وجود عمليات الفلورسنت الدقيقة للخلايا الدبقية الشعاعية التي تمتد على الصفيحة المترافقة بأكملها إلى وجود سقالة دبقية شعاعية سليمة تستخدم عن طريق الخلايا العصبية المترافقة المهاجرة.

انقل ملحق الغشاء بشريحة مختارة إلى طبق زجاجي القاع بقطر 50 ملم يحتوي على ملليلترين من وسط زراعة الشرائح. ضع الطبق في غرفة المناخ في المجهر متحد البؤر. اضبط الدقة على 512 × 512 بكسل.

قم بزيادة سرعة المسح الضوئي من 400 هرتز إلى 700 هرتز لزيادة معدل الإطارات من حوالي 1.4 إلى حوالي 2.5 إطار في الثانية. لا تستخدم أكثر من مرتين في المتوسط. حدد مكدس Z من خلال المنطقة المثقبة بالكهرباء بحجم خطوة 1.5 ميكرون.

ابدأ سلسلة الفاصل الزمني بأخذ مكدس Z كل 30 دقيقة. تسمح الإعدادات الموضحة بدقة وسطوع كافيين للصورة مع الحفاظ على تلف الصورة منخفضا أثناء الاستحواذ. يظهر هذا الفيلم الخلايا العصبية القشرية E16.5 وهي تهاجر من المناطق تحت البطينية إلى الصفيحة القشرية.

في Bcl11a floxed الوراثية الشرطية بعد التثقيب الكهربائي لبلازميد التحكم IRES-GFP في اليوم الجنيني 14.5. يتكون الفيلم من 108 إطارات بمعدل خمسة إطارات في الثانية. يمثل شريط المقياس 100 ميكرون.

أثر التثقيب الكهربائي لناقل بلازميد الحمض النووي الذي يحتوي على Cre-IRES-GFP على هجرة الخلايا العصبية القشرية في أدمغة Bcl11a المشروطة. كما هو موضح هنا ، يتحرك عدد قليل جدا من الخلايا العصبية عبر المنطقة المتوسطة للوصول إلى الصفيحة القشرية. يظهر هذا الفيلم استقطاب الخلايا العصبية القشرية من عنصر تحكم مسمى GFP على اليسار مقارنة بالخلايا العصبية من Bcl11a المتحولة على اليمين.

تم الحصول على هذه الآثار المتحركة للتحكم التمثيلي في الخلايا العصبية الطافرة Bcl11a من سلسلة الفاصل الزمني لثقافات شرائح E16.5 بدقة فاصل زمني مدتها ساعة واحدة. مرة أخرى ، تظهر البيانات من الدماغ الضابط على اليسار وتظهر بيانات من الدماغ الكهربائي Cre-IRES-GFP على اليمين. كما يتضح من هذه المجموعة من الآثار التمثيلية من التحكم وثقافات الشرائح الطافرة Bcl11a ، غالبا ما تخضع الخلايا العصبية الطافرة Bcl11a لمراحل متكررة من انخفاض سرعة الهجرة وتغيير الاتجاه بشكل عشوائي كما هو موضح برؤوس الأسهم الحمراء.

يمكن حساب ملفات تعريف السرعة من آثار الخلايا العصبية المهاجرة. كما هو موضح هنا ، فإن نسبة أكبر من الخلايا العصبية الطافرة Bcl11a لها سرعات هجرة أبطأ مقارنة بالضوابط. يمكن حساب زاوية الانحراف من بيانات التتبع.

كما يتضح من هذا الرسم البياني ، فإن الخلايا العصبية الطافرة Bcl11a التي تمثلها الأشرطة السوداء تظهر زوايا انحراف أكبر مقارنة بالضوابط. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من ساعتين لكل منهما للتثقيب الكهربائي في الرحم وإعداد ثقافة شريحة الدماغ العضوية. يمكن تكييف هذا الإجراء بسهولة لإجراء تحليل تجزيئي للجينات ذات الأهمية في الخلايا العصبية القشرية المهاجرة شعاعيا عن طريق اكتساب وفقدان الوظيفة بالإضافة إلى تجارب الأوعية الدموية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مراقبة الخلايا العصبية المهاجرة شعاعيا مباشرة في ثقافة الشرائح العضوية المحضرة من الأدمغة الجنينية المثقبة بالكهرباء عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر بفاصل زمني.