تحديد وتوصيف العوامل المنتشر بنقل الجينات في رواية التمزق--الوسم؛ مزق--tva النموذجي مورين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وتوصيف العوامل النقيلية عن طريق نقل الجينات إلى Novel RIP-Tag. نموذج الماوس RIP-TVA. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ورم خبيث للسرطان مثل تحديد الدوافع والأهداف العلاجية الجديدة. تتمثل الميزة الرئيسية لنموذج الفأر هذا للسرطان في تحديد العوامل النقيلية عن طريق نقل الجينات الجسدية إلى جحافل سلائف خلايا بيتا البنكرياسية.

ابدأ بحصاد طبق واحد بطول 15 سم من خلايا DF1 المنتجة للفيروس لكل فأر للإصابة بالعدوى. أولا ، اجمع الوسط من الأطباق المتقاربة التي يبلغ طولها 15 سم. ثم قم بإزالة بقايا الخلية عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا لمدة 10 دقائق عند 1650 مرة درجة مئوية وأربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، انقل المادة الطافية الفيروسية إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة. تدور في جهاز طرد مركزي فائق لمدة 1.5 ساعة عند 9540 مرة درجة مئوية وأربع درجات مئوية. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية من أنابيب الطرد المركزي الفائق.

ثم أضف PBS إلى أنبوب الطرد المركزي الفائق لعمل التعليق الفيروسي النهائي 100 ميكرولتر لكل طبق 15 سم. قم بتغطية الأنابيب بغشاء مختبري وأعد تعليق الحبيبات الفيروسية غير المرئية عن طريق الدوامة لمدة دقيقتين بسرعة متوسطة. ثم هز أنابيب الطرد المركزي الفائق عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة أو بين عشية وضحاها.

بعد الحضانة ، انقل المعلق الفيروسي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق واستمر في معايرة الفيروس. ابدأ إجراء المعايرة بالتأكد من أن خلايا DF1 الموجودة في 12 لوحة لزراعة أنسجة البئر قد وصلت إلى التقاء 30٪. هناك حاجة إلى لوحة واحدة من اثني عشر بئر لكل تحديد عيار فيروسي.

ابدأ التخفيف التسلسلي عشرة أضعاف للطافية الفيروسية عن طريق خلط خمسة ميكرولترات من المادة الطافية الفيروسية مع 495 ميكرولترا من وسط النمو في أنبوب الطرد المركزي الدقيق لعمل عشرة إلى التخفيف الثاني. دوامة لفترة وجيزة لبضع ثوان. ثم انقل 40 ميكرولترا من العشرة إلى التخفيف الثاني إلى 360 ميكرولترا من وسط النمو في أنبوب طرد مركزي دقيق للتخفيف من عشرة إلى الثالث.

دوامة لفترة وجيزة لبضع ثوان. استمر في هذه العملية للتخفيف إلى عشرة إلى الرابع وعشرة إلى الخامس. بعد ذلك ، قم بتوزيع 2.25 ملليلتر من وسط النمو في كل من خمسة أنابيب بوليسترين سعة ستة ملليلتر.

وقم بتسميتهم عشرة إلى السادس، وعشرة إلى السابع، وعشرة إلى الثامنة، وعشرة إلى التاسع، والعشرة إلى العاشرة على التوالي. امزج 0.25 مل من التخفيف من عشرة إلى الخامس مع 2.25 مل من وسط النمو في أنبوب البوليسترين ستة ملليلتر للتخفيف من عشرة إلى سادس. دوامة لفترة وجيزة لبضع ثوان.

كرر الإجراء لمدة عشرة إلى سابع ، وعشرة إلى ثامن ، وعشرة إلى التاسع ، وعشرة إلى التخفيفات العاشرة. بعد ذلك ، قم بإزالة وسط الثقافة الأصلي من خلايا DF1 على 12 لوحة بئر. وأضف ملليلتر واحد من الفيروس المخفف إلى كل بئر في نسختين.

اسمح للخلايا بالنمو عند 37 درجة مئوية و 5 ثاني أكسيد الكربون لمدة سبعة أيام على الأقل. ابدأ إجراء العدوى عن طريق تخدير فأر RIP-Tag RIP-tva عمره سبعة أسابيع أولا. ضع مادة تشحيم العين على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية.

احلق الشعر من تجويف الصدر في الماوس RIP-Tag RIP-tva ، ضع الماوس على ظهره بحيث يكون الصدر متجها لأعلى على ورق مقعد مختبر ماص فوق جهاز تسخين آمن. قم بإجراء قرصة إصبع القدم لفحص لعدم استجابته وتأكيد تأثير التخدير الكامل. مد الأطراف الأمامية وقم بتثبيتها بشريط لاصق.

ضع علامة على صدر الفأر للحقن. حدد الموقع في منتصف الطريق بين الشق القصي والجزء العلوي من عملية الخنجري ، ويسار تشريحيا قليلا من القص. ثم افرك جدار الصدر الأمامي إما بمقشر بوفيدون اليود أو مقشر الكلورهيكسيدين ، متبوعا بكحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ أو إسفنجة شاش مبللة بالإيثانول بنسبة 70٪.

اسحب 50 ميكرولترا من الهواء في حقنة أنسولين معقمة قياس 28.5 لتوفير مسافة بين المكبس والغضروف المفصلي لحقنة سعة 500 ميكرولتر. ارسم 100 ميكرولتر من الفيروس. يعد المجال الجوي بدون أي سائل على الحائط أمرا بالغ الأهمية لرؤية نبض القلب.

حافظ على الإبرة في وضع مستقيم ، وامسك جلد الماوس مشدودا بيد واحدة وأدخل الإبرة في الموقع المحدد. عندما تظهر نبضة حمراء زاهية من الدم في المحقنة ، توقف عن تقدم الإبرة وقم بإصلاح عمق الإبرة في الماوس بيد واحدة. استخدم اليد الأخرى لدفع المكبس بعناية وببطء لتوصيل التعليق الفيروسي على مدى فترة 60 ثانية تقريبا.

قم بتوصيل 10-20 ميكرولتر كلما ظهرت نبضة حمراء زاهية من الدم في المحقنة. يشير الدخول المستمر للدم الأحمر المؤكسج إلى محور الإبرة الشفاف إلى الوضع الصحيح للإبرة في البطين الأيسر. بعد الدفعة الأخيرة للنهب لتوصيل تعليق فيروسي وقبل رؤية النبض الأحمر التالي للدم ، اسحب الإبرة بسرعة من تجويف الصدر.

ضع ضغطا برفق على موقع الحقن لمدة دقيقة واحدة على الأقل لتقليل النزيف. ثم حرك الماوس بعناية على وسادة تدفئة أو تحت مصباح حراري حتى يصبح واعيا تماما. أصيبت الفئران RIP-Tag RIP-tva بالفيروس الرجعي RCASBP-Bcl-xL المشار إليه في عمر سبعة أسابيع وتم قتلها رحيما في عمر 16 أسبوعا.

تظهر هذه الصورة تلطيخ المشبكي التمثيلي لأورام الغدد الصم العصبية في البنكرياس النقيلي في الغدد الليمفاوية في البنكرياس. هنا أصيبت الفئران RIP-Tag RIP-tva ب RCASBP-RHAM B المشار إليها ، تظهر هذه الصورة تلطيخ المشبكي التمثيلي لأورام الغدد الصم العصبية في البنكرياس النقيلية في الغدد الليمفاوية في البنكرياس. هنا يظهر تلطيخ synaptophysin في الكبد بعد حقن فيروس RCASBP-RHAMM B.

من المهم أن نتذكر أن عنوان أكثر من عشرة إلى ثماني وحدات معدية لكل مليلتر مطلوب للعدوى في الجسم الحي لخلايا TVA المتكاثرة في فأر RIP-Tag RIP-tva ويمكن لرئيس الجامعة الفيروسي الرجعي RCASBP أن يوفر CDNA يصل إلى 2.5 كيلو قاعدة. بعد تطوير نموذج الفأر هذا ، مهد الطريق لتغيير النموذج الذي يكشف فيه أن BCL-xL يعزز في الواقع ورم خبيث للسرطان بغض النظر عن وظيفته المضادة لموت الخلايا المبرمج.