تحليل الفائق للسلوك الحركي في مقايسة الجزيرة المورفولوجية

الهدف العام من اختبار الجزيرة (Island Assay) هو تقييم السلوك الحركي الأساسي لذبابة Drosophila melanogaster عن طريق المعالجة التلقائية للبيانات والقياس الكمي الموضوعي. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد المنظمات الرئيسية للسلوك الحركي، مثل الجينات المرتبطة باضطرابات الحركة، كما يمكن استخدامها لاختبار الأدوية التي قد تعالج هذه العيوب.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح قياساً كمياً عالي الإنتاجية لسلوك الحركة في ذبابة Drosophila، مما يجعل هذه التقنية مناسبة لعمليات الفحص واسعة النطاق. وقد قررنا تطوير هذه المنهجية لنتمكن من تحليل عدد كبير من نماذج الأمراض، وكنا بحاجة إلى تحليل مؤتمت لبيانات الصور لجعل ذلك ممكناً.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدًا للغاية. فهناك عدة خطوات في معالجة beta تعتبر حاسمة، وقد تكون صعبة على المستخدمين الجدد، خاصة أولئك غير الملمين بحزم البرمجيات المستخدمة. أولًا، قم بتحضير ثلاثة قوارير على الأقل لكل حالة تجريبية ككرارات بيولوجية.

يجب أن يحتوي كل ملف على 15 ذبابة تقريباً من نفس الجنس وعمر متقارب. ومن المهم أن تكون أجنحة الذباب سليمة. قم بإنشاء المجلدات لتخزين التجارب.

قم بإنشاء هذه الملفات في هيكل مجلدات محدد بناءً على الظروف والمكررات. على سبيل المثال، إذا كانت التجربة تتضمن نمطين جينيين بخمس مكررات لكل منهما، فقم بإنشاء مجلد رئيسي يحمل تاريخ التجربة، وداخل هذا المجلد، أنشئ مجلدًا فرعيًا لكل نمط جيني. ثم، داخل مجلدات الأنماط الجينية، أنشئ مجلدات فرعية لكل مكرر.

بعد ذلك، قم بتجهيز جهاز الاختبار. أضف الماء البارد مع كمية صغيرة من الصابون إلى صينية الحوض، وضع المنصة في منتصف الحوض، إذا لم تكن مثبتة فيه بالفعل. غطِّ الصينية والمنصة بصندوق شفاف.

لإضاءة المنصة، ضع مصباحاً بارداً، مثل مصابيح LED العادية بجهد 12 فولت، فوقها. كما يجب وضع كاميرا ويب متصلة بجهاز كمبيوتر مباشرة فوق المنصة. ثم قم بفتح برنامج تسجيل الصور على جهاز الكمبيوتر.

من نظام القائمة، حدد كاميرا الويب المناسبة كجهاز التقاط. ضع ذبابة ميتة على المنصة لضبط إعدادات الفيديو. قم بتعديل السطوع والتباين واللون في البرنامج بحيث تظهر الذبابة الميتة باللون الأسود على خلفية بيضاء.

بعد ذلك، قم بضبط إعدادات تصوير الفاصل الزمني (time lapse) لحفظ المقاطع بتنسيق ملفات AVI. ثم، تصفح المجلد الذي سيتم حفظ البيانات فيه، وحدد اسم المقطع. احفظ هذه التغييرات.

لضغط بيانات الصورة، اختر ترميز Intel IYUV. اضبط سرعة التسجيل على إطار واحد كل 0.1 ثانية، وقم بتعديل معدل التشغيل المقابل ليكون 10 صور في الثانية. وأخيراً، انتقل إلى الإعدادات المتقدمة وحدد خيار Create a bmp image for each captured frame.

بعد ذلك، انتقل إلى الدليل نفسه الذي اخترته لاستضافة ملفات AVI واضغط موافق. قبل البدء، تأكد من أن الجزيرة فارغة ونظيفة. ثم، ابدأ التسجيل في واجهة صور التصوير الزمني الخاصة ببرنامج تسجيل الصور.

خذ قارورة تحتوي على الذباب وقم بالنقر عليها مرتين أو ثلاث مرات لإسقاط جميع الذباب إلى القاع. بعد ذلك، أزل السدادة بسرعة من القارورة وانقر بقوة لإسقاط الذباب على المنصة. يجب أن يصطدم الجميع بالمنصة في الوقت نفسه تقريباً.

امنح الذباب ما يصل إلى 30 ثانية لمغادرة المنصة، ثم أوقف التسجيل. إذا لزم الأمر، قم بإزالة أي ذباب متبقٍ من المنصة يدويًا. قبل الانتقال إلى التجربة التالية، تأكد من إعادة تحديد الدليل الذي سيتم فيه تخزين المجموعة التالية من البيانات.

تتمثل المهمة الأولى في إنتاج مجموعات (stacks) ومساقط (projections) لسلسلة الصور التي تم جمعها. في برنامج Fiji، افتح Drosophila Island Assay. وفي النافذة الجديدة، أدخل معرف السلسلة الزمنية للصورة الأولى.

بعد ذلك، حدد الماكرو الفرعي الخاص بإنشاء المكدس والإسقاط (create stack and projection) فقط. انقر فوق "موافق"، ثم وجه الكمبيوتر إلى المجلد الذي يحتوي على جميع المجلدات الفرعية الخاصة بتجارب مقايسة الجزيرة (Island Assay) الفردية. بعد معالجة البيانات، سيظهر ملفان جديدان في كل مجلد فرعي تجريبي فردي.

المهمة التالية هي تحديد الموقع الدقيق للمنصة في الصور. افتح الواجهة الرسومية وحدد مربع اختيار "تحديد المنصة". بعد ذلك، اختر الدليل الذي تُخزن فيه المجلدات الفرعية التجريبية.

ستفتح صورة الإسقاط ونافذتان. في الصورة الأولى، ارسم مضلعاً فوق رصيف الجزيرة باستخدام أداة اختيار المضلع. لا تضمن خط الحدود الموجود عند محيط الرصيف في هذا الاختيار.

أضف التحديد إلى نافذة مدير ROI بالنقر على add في نافذة مدير ROI. بعد إضافة التحديد إلى مدير ROI، سيظهر كمجموعة من القيم. ثم، انقر على okay في نافذة define the platform.

سينتقل البرنامج إلى صورة الإسقاط التالية المخزنة في المجلد. استمر في تطبيق منطقة الاهتمام (ROI) ذاتها للمنصة على صورة الإسقاط التالية عن طريق تحديد منطقة الاهتمام المخزنة في مدير مناطق الاهتمام (ROI manager) وتأكيد هذه المنطقة في نافذة "تعريف المنصة" (define the platform). وقبل الانتقال إلى صورة الإسقاط التالية، تأكد من أن المنصة لم تتحرك أثناء التجربة.

إذا تغير موضع المنصة، انقر بزر الفأرة الأيسر في مركز التحديد واسحبه إلى الموضع المطلوب. وإذا كان مربع التحديد لا يتطابق مع المنصة، فانقر بزر الفأرة الأيسر خارج نطاق التحديد وحدد منطقة جديدة للمنصة باستخدام أداة المضلع (polygon tool). ثم أضف هذا التحديد الجديد إلى مدير المناطق ذات الاهتمام (ROI manager).

بعد ذلك، تحقق من التحديد الجديد بالنقر فوق "موافق" (okay) في نافذة تعريف المنصة (define platform)، وتابع الإجراء حتى يتم تعريف المنصات لجميع الصور بشكل صحيح. وتتمثل المهمة النهائية قبل معالجة البيانات في تحديد الحد الأدنى لحجم الذبابة، وهو ما تم شرحه في البروتوكول النصي.

لتقدير عدد الذباب الهارب من المنصة، قم أولاً بتحديد الحد الأدنى لحجم الذبابة. بعد ذلك، حدد أكبر عدد من الذباب في ملف واحد ضمن السلسلة التجريبية. ابدأ وظيفة التحليل، وعند ظهور المطالبة، اختر الدليل الرئيسي للتجربة.

بعد تشغيل الماكرو، لاحظ ظهور ملف نتائج جديد ومجموعة صور جديدة في كل مجلد. افتح هذه الملفات للتأكد من أن الإجراء قد تم بشكل صحيح. قم بتشغيل حزمة برمجيات R أو RStudio وافتح نص تحليل Island Assay لمعالجة جميع التجارب في وقت واحد.

يجب تحرير السكريبت بشكل صحيح لضمان نجاح التحليل. في السطر 16 من السكريبت، أدخل مسار الدليل الرئيسي الذي يحتوي على التجارب المراد تحليلها. وفي السطر 19، أدخل مسار المجلد الذي يجب تخزين ملفات مخرجات التحليل فيه.

يجب أن يكون الأخير موقعاً مختلفاً عن الدليل الذي يحتوي على بيانات الصور المراد تحليلها. الآن، قم بتشغيل السكربت من شريط الأدوات وابدأ في تحليل النتائج. يقوم سكربت Island Assay analysis بتصدير رسم بياني خطي لكل حالة تجريبية.

يوضح الرسم البياني النسبة المئوية للذباب المتبقي على المنصة بمرور الوقت لكل مكررة من تلك الحالة. ويلخص الرسم البياني الخطي المصدر، escape response:all conditions، المتوسط والخطأ المعياري لمتوسط استجابة الهروب الطيراني لأول 12 حالة تجريبية موجودة في المجلد الرئيسي. كما يتم حساب المساحة تحت المنحنى لكل مكررة تجريبية لتحديد ما إذا كانت الحالات التجريبية تختلف عن بعضها البعض بشكل ملحوظ.

يتم تصدير المساحة تحت المنحنى والقيمة الوسيطة لكل حالة تجريبية على شكل رسم بياني. وبناءً على عدد الحالات الموجودة في المجلد الرئيسي، سيقوم البرنامج بتنفيذ إما اختبار Welch T-test غير مقترن ثنائي الذيل لحالتين، أو تحليل التباين (anova) مع تصحيح Tukey لأكثر من حالتين. كما يتم تصدير وحفظ جميع البيانات الرقمية التي تم حسابها بواسطة تحليل Island Assay كملفات csv أو txt في مجلد مخرجات البيانات.

تعد توسع الشعيرات وعجز المخيخ (Ataxia telangiectasia) اضطراباً حركياً متنحياً مرتبطاً بكروموسوم جسدي، وينتج عن طفرات في جين ATM. يتميز هذا المرض بالظهور المبكر لترنح المخيخ. وقد تم فحص تأثير تثبيط التعبير الجيني الشامل للنسخة المتناظرة لجين ATM في ذبابة الفاكهة باستخدام مقايسة الجزيرة (Island Assay) ومقارنتها بمجموعات الضبط.

بشكل عام، أدى التثبيط الشامل والمنتشر لنظير ATM في ذبابة الفاكهة، Tefu، إلى انخفاض ملحوظ في الأداء الحركي في اختبار الجزيرة (Island Assay) مقارنة بمجموعات الضبط ذات الخلفية الجينية. وقد أسفر التحليل اليدوي لبيانات اختبار الجزيرة المسجلة عن نفس نتيجة التحليل الآلي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء اختبار الجزيرة، وكيفية تشغيل ماكرو اختبار الجزيرة لذبابة الفاكهة (Drosophila Island Assay macro)، وكيفية تشغيل سكربت تحليل اختبار الجزيرة.

عند تطبيق هذا البروتوكول، من المهم تذكر أن جودة تقسيم الصور ترتبط ارتباطاً وثيقاً بجودة المقاطع المصورة؛ فكلما كان التباين أفضل، كانت عملية التحليل أكثر سلاسة. وبعد تطويرها، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف القدرة الحركية في ذبابة Drosophila بإنتاجية عالية.

بعد استخدام هذا المقايسة، يمكن استخدام مقايسات أخرى، مثل تلك التي تختبر الانتحاء الأرضي السلبي، لمزيد من الاستقصاء حول عيوب الحركة.