القرار أولتراهيغ الماوس الضوئية التماسك التصوير المقطعي لمساعدة الحقن داخل مقلة العين في أبحاث العلاج الجيني الشبكية

الهدف العام لهذا الإجراء الحقن تحت الوريتيني هو تقديم ناقل إلى شبكية العين بطريقة طفيفة التوغل وقابلة للتكرار التي يمكن ملاحظتها في الوقت الحقيقي. مرحبا، يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في أبحاث العلاج الجيني حول فعالية تسليم ناقلات والسمية وكيل العلاجية. وتشمل بعض مزايا هذه التقنية الحد الأدنى من الضرر في شبكية العين وهياكل العين الأخرى، وتحديد مواقع الحقن الدقيقة، والقياسات الكمية الدقيقة في القياسات الحية التي تسمح بالاستدلال الإحصائي الصلب.

لحقن transgene داخل العين، ضع أولا فأر تخدير على مرحلة عرض مجهر نظام تصوير الشبكية ووضع نصائح من ملقط قزحية حادة عقيمة في المواضع السابعة و 10 صباحا من الجفن في حين دفع ملقط مفتوحة ونزولا للحث بلطف proptosis. استخدام ملقط لاقناع الجفون تحت الكرة الأرضية العين وتوجيه غيض من إبرة إلى حوالي 1-1.5 ملليمتر تحت حافة أطراف القرنية. بعد ذلك، تطبيق قطرة من محلول PBS العقيم على العين وتغطية العين مع زلة غطاء معقمة.

دفع الإبرة بعناية في العين من خلال الملتحمة حتى يتم إنشاء الاكتئاب الصلب. استخدام المتلاعب الصغرى لتدوير العين إلى أعلى حتى الاكتئاب تصلب في التركيز، ثم دفع الإبرة إلى الأمام لخلق ذروة حادة في شبكية العين مع غيض من الإبرة. باستخدام حامل الإبرة، قم بتدوير الإبرة فقط حتى يتم غمر طرف الإبرة من خلال الصلبة وRPE، مما يسمح للطحين في طرف الإبرة بأن يكون مرئيًا تحت نسيج الشبكية في المنطقة المجاورة مباشرة للفضاء تحت الشبكية وصبغة شبكية العين خلية أحادية الصباغ.

محرك غيض من إبرة إلى أسفل بحيث يكون عرضية إلى العالم، ثم تفعيل مضخة الحقن مع التبديل دواسة القدم. بعد 0.5 إلى 1 microliters من حل transgene قد سلمت إلى الفضاء تحت الأمعاء، وسحب الإبرة والتأكد من أن الدم مستقر وأن السائل لا تسرب من موقع المسالك الحقن. لتأكيد نجاح الحقن، سجل حجم مستطيل OCT وقارن الصور إلى صور لأنواع مختلفة من نتائج الحقن المحتملة.

بعد تأكيد موضع الحقن السليم، استخدم صورة OCT المستطيلة لرسم خريطة لمدى bleb على صورة صندوق. لرسم خريطة لمدى bleb تحت المجرد، فتح حجم مستطيل OCT صورة من bleb بحيث يتم تضمين معلم يمكن التعرف عليها داخل العين في الصورة. إضافة العديد من الفرجار حسب الضرورة لتحديد موقف الحواف اليسرى واليسرى من مسح B، وكذلك رئيس العصب البصري، ONH، إذا كان موجودا، ونقطة انقلاب حيث تنفصل الشبكية من RPE والمشيمية ومن ثم حفظ البيانات.

ثم تجميع الملفات المحفوظة ومؤامرة البيانات ، وخلق خريطة فعالة من bleb حقن على صورة EN FACE OCT. تراكب البيانات المرسومة على صورة صندوق التي تحتوي على موقع الحقن وحفظ الصورة المدمجة. استخدم هذه الصورة لتحديد المناطق التي تهمك أثناء متابعة تصوير OCT.

لتقييم انحطاط الشبكية بعد الحقن، قم أولاً بفتح نطاق طيفي عالي الدقة مسجل في OCT أو HRSD OCT صورة حجم مستطيلة وحدد مسح B ليتم قياسه. تكبير الصورة المحددة حتى تملأ الشاشة وانقر على الحق على الصورة. انقر فوق الفرجار لتحديد العدد المناسب من الفرجار، ثم استخدم ميزة تكوين الفرجر لتعيين الفرجر الرأسي في عمود كتلة الزاوية وتشغيل موقع الفرجار العرض لتسهيل وضع الفرجار موحدة عبر شبكية العين.

انقر فوق تطبيق ونقل كل الفرجر إلى الموقع المناسب 0.1 إلى 0.2 ملليمتر بعيداً عن طريق المسح الضوئي B، مع الحرص على وضع الفرجار واحد في مركز رأس العصب البصري عند الاقتضاء. عندما تم وضع جميع الفرجار، انقر واسحب كل الفرجر إلى طول المنطقة ذات الاهتمام، وضع الفرجار بشكل تعسفي لا تراكب المناطق القابلة للقياس من المسح الضوئي B إلى أقصى طول. لقياس سمك الطبقة النووية الخارجية، ضع الجزء العلوي من كل الفرجر في الغشاء الخارجي المحدد وأسفل كل الفرجر في الجزء السفلي من طبقة شبكية خارجية في 0.1 إلى 0.2 ملليمتر زيادات عبر الشبكية.

بعد أن تم وضع جميع الفرجار وتعديلها إلى الحجم، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الصورة وانقر فوق حفظ بيانات الفرجر"ثم كرر القياسات كما هو موضح فقط لكل مسح B العاشرة، مع الحفاظ على الفرجر مفتوحة وفي نفس الموقع على المحور س وضبط أطوال الفرجر حسب الضرورة، دون نقلها في الاتجاه س. عندما تم قياس كافة عمليات المسح الضوئي، افتح ملفات البيانات المحفوظة وانقر فوق تاريخ تعديل "لترتيب الملفات وفقا للوقت المحفوظة. فتح كافة الملفات لكل مسح ب قياس وتجميع البيانات الأولية من كل B المسح الضوئي في ملف واحد من أدنى إلى أعلى عدد الإطار وحدد أعمدة البيانات، بما في ذلك اسم الفرجر، وطول، والأعمدة X الوسط.

تأكد من أن المركز X هو نفسه لجميع عمليات المسح B التي تم قياسها لكل صورة مستطيلة الحجم OCT تتم معالجتها وحذف أي بيانات من الفرجار التي لم يتم استخدامها لتسجيل القياسات. تعيين الفرجر الموجود في مركز رئيس العصب البصري إلى الصفر ومؤامرة البيانات لX مقابل مجموعات بيانات Y متعددة للحصول على وظيفة مؤامرة 3D لسمك الطبقة النووية الخارجية أو أي طبقة أخرى قياس شبكية العين. ثم قارن قياسات الطبقة النووية الخارجية بين السيطرة والحيوانات التجريبية مع الأعمار المقابلة لتحديد معدل والتوحيد من أي انحطاط الشبكية المحتملة.

بالنسبة لرسم خرائط ثلاثية الأبعاد لقياسات شبكية العين ، راجع صور OCT بعد الحقن ولاحظ أي معالم يمكن تحديدها ، ثم ضع الحيوان للحصول على صورة SDO CT متابعة من نفس المنطقة ، مع الحرص على تضمين نفس المعالم القابلة للتحديد ، ومعالجة الصور المسجلة كما هو موضح للتو. من المهم جدا الحصول على صور OCT عالية الجودة التي تشمل معالم يمكن التعرف عليها لتسهيل إعادة تصوير مناطق الشبكية التي تم حقنها سابقًا. من أجل قياس التغيرات في طول نظام التشغيل، وضعت الفرجار من الغشاء الخارجي الحد إلى غشاء بروكس، مما يسمح لقياسات موثوقة منذ يتم التعرف بسهولة على هذه الطبقات في الصور أكتوبر.

وقد عُزيت الاختلافات في القياسات بين هذه الطبقات من خطوط ماوس مختلفة إلى أطوال القطعة الخارجية الأقصر. إذا تم إجراء الحقن تحت الوريتينال بنجاح، فتح الفضاء تحت الوريتيني يحفز إنتاج bleb التي يمكن تصورها بوضوح سواء في عرض الوجه en من التصوير هك أكتوبر HRSD وفي الصور مسح B. يتيح تحديد خريطة الحدود لموقع الحقن تجزئة قياسات أنسجة الشبكية ومجموعات بيانات موضع الفرجر للسماح بإجراء اختبارات إحصائية لاحقة لآثار عوامل علاجية محددة على انحطاط الشبكية.

مرة واحدة يتقن، يمكن أن تكتمل هذه التقنية في عشر دقائق إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر للحفاظ على بيئة جراحية نظيفة وعقيمة. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلاج الجيني لمراقبة عملية الحقن الجراحية الفرعية بأكملها في الوقت الحقيقي وخلقت طريقة لتحديد النجاح الجراحي على الفور في الجسم الحي.

بعد إجراء الحقن هذا، OCT وغيرها من الطرق مثل إعادة التصوير بالكهرباء يمكن تنفيذها للإجابة على أسئلة إضافية حول الإنقاذ الوظيفي transgene و / أو السمية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم كيفية تنفيذ الحقن تحت الشبكية عبر كلية وعبر االبرقية، وكيفية رسم خريطة لمدى حقن bleb على أكتوبر من هذه الصورة، والحصول على قياسات صارمة لطبقات الشبكية الخارجية. لا تنس أن العمل مع ناقلات العلاج الجيني يمكن أن تكون خطرة وأن الاحتياطات، مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة يجب أن تستخدم دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.