Name: تحليل هيستون الأجسام المضادة خصوصية مع ميكروأرس الببتيد (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: اكتشف خطوط أنابيب متكاملة لتصميم وتحليل مصفوفات الببتيد لتحديد خصوصية أجسام مضادة الهيستون في أبحاث الكروماتين. تعزز هذه الطريقة موثوقية التحكم في جودة الأجسام المضادة للدراسات الوراثية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل في جزء من معهد بحوث فان أندل ومنحة بحثية من المعاهد الوطنية للصحة (CA181343) ل سبر

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

موثوقية الأجسام المضادة في تطبيقات البحوث الطبية الحيوية أمر بالغ الأهمية 46 ، 47 . هذا صحيح بشكل خاص في الكيمياء الحيوية لونين نظرا لموقف الأجسام المضادة كأدوات رئيسية لغالبية التقنيات المتقدمة لتوصيف وفرة وتوزيع هيتمون بتمس. بروتوكول المعروضة هنا تفاصيل خط أنابيب الأمثل لتصميم وتصنيع، واستخدام ميكروأرس الببتيد لتحليل خصوصية هيستون بتم الضد. وقد تم استخدام هذا الخط لفحص عدد كبير من الأجسام المضادة هيستون بتم المتاحة تجاري...

يتم تعبئة الحمض النووي الجيني بشكل أنيق داخل النواة النواة النواة النواة مع بروتينات هيستون لتكوين الكروماتين. وحدة فرعية من الكروماتين تكرار هو نوكليوسوم، والذي يتكون من 147 زوجا قاعدة من الحمض النووي ملفوفة حول جوهر أوكتامريك من البروتينات هيستون - H2A، H2B، H3، و H4 1 . وينظم الكروماتين على نطاق واسع في يوكروماتين معبأة فضفاضة ومجالات هيتيروكروماتين معبأة بإحكام. درجة ضغط الكروماتين ينظم المدى الذي يمكن للأجهزة البروتين الوصول إلى الحمض النووي الأساسي لتنفيذ العمليات الأساسية الحمض النووي مثل النسخ المتماثل، والنسخ، وإصلاح. المنظمين الرئيسيين للوصول الجينوم في سياق لونين هي بتمس على الذيل غير المهيكلة والنطاقات الأساسية للبروتينات هيستون 2 ، 3 . هيستون بتمس وظيفة مباشرة من خلال التأثير على بنية لونين 4 وغير مباشر ثروغح تجنيد بروتينات القارئ والمجمعات الجزيئات المرتبطة بها التي لديها إعادة عرض لونين، الأنزيمية، والأنشطة السقالات 5 . دراسات على وظيفة هيستون بتم على مدى العقدين الماضيين تقترح بأغلبية ساحقة هذه العلامات تلعب الأدوار الرئيسية في تنظيم مصير الخلية، والتنمية الكائن الحي، ومرض بدء / التقدم. مدعوم من التقدم في تكنولوجيا الطيف الكتلي المستندة إلى البروتين، تم اكتشاف أكثر من 20 بتمس هيستون فريدة من نوعها على أكثر من 80 مخلفات هيستون متميزة 6 . ومن الجدير بالذكر أن هذه التعديلات غالبا ما تحدث في توليفات، وتمشيا مع فرضية &quot;هيستون كود&quot;، العديد من الدراسات تشير إلى أن البروتينات القارئ تستهدف مناطق منفصلة من الكروماتين من خلال الاعتراف مجموعات محددة من هيستون بتمس 7 ، 8 ، 9 . والتحدي الرئيسي الذي سيتحرك إلى الأمام هو تعيين وظائف إلى غربسبب قائمة هيتمون بتمس وتحديد كيفية تركيبات محددة من هيستون بتمس أوركسترات وظائف ديناميكية المرتبطة بالكروماتين. الأجسام المضادة هي الكواشف لينكبين للكشف عن هيستون بتمس. وعلى هذا النحو، فقد تم تطوير أكثر من 1000 هيستون من الأجسام المضادة المتمثلة في هيتمون تجاريا لاستخدامها في أبحاث الكيمياء الحيوية للكروماتين. مع التطور السريع لتكنولوجيا تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية، وتستخدم هذه الكواشف على نطاق واسع من قبل المحققين الفردية وعلى نطاق واسع إبيجنوميكس &quot;خارطة الطريق&quot; المبادرات (على سبيل المثال ، إنكود و بوبرينت) في تشيب-سيق (الكروماتين مناعي إلى جانب الجيل القادم التسلسل ) لتوليد خرائط المكانية عالية الدقة لتوزيع هيستون بتم على نطاق الجينوم 10 ، 11 . ومع ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة أن خصوصية الأجسام المضادة هيستون بتم يمكن أن تكون متغيرة للغاية، وأن هذه الكواشف تظهر غير صالحة<html> ( مثل ، أحادي أو ثنائي أو ثلاثي ميليليسين) 12 و 13 و 14 و 15 ، 16 ، 17 ، 18 . لذلك، مراقبة الجودة الصارمة من هيستون بتم-الكواشف الأجسام المضادة محددة ضروري لتفسير البيانات التي تم إنشاؤها بدقة مع هذه الكواشف القيمة. تكنولوجيا ميكروأري تمكن الاستجواب في وقت واحد من الآلاف من التفاعلات الجزيئية في إنتاجية عالية، استنساخه، وتصغيرها الشكل. لهذا السبب، تم إنشاء مجموعة متنوعة من منصات ميكروأري لتحليل البروتين الحمض النووي 19 ،&quot;&gt; 20 والبروتينات البروتين 21 ، والتفاعلات الببتيد البروتين 22. في الواقع، وقد ظهرت ميكروأرس الببتيد هيستون كمنصة اكتشاف بالمعلومات للبحوث الكيمياء الحيوية لونين، مما يتيح التنميط الإنتاجية العالية للكتاب، محايات، وقراء هيستون بتمس 15 ، 23 ، 24 ، وأيضا لتحليل هيستون خصوصية الأجسام المضادة 17 ، 25. أبعد من تطبيقها في الكروماتين والبحوث علم الوراثة، صفائف الببتيد هيستون لها فائدة محتملة كاختبار التشخيص / النذير لذئبة الحمامية الجهازية وأمراض المناعة الذاتية الأخرى حيث المضادة للالتهابات، يتم إنشاء الأجسام المضادة لونين 26 ، 27 . هنا، نحن تصف خط أنابيب المتكاملة التي وضعناها لتصميم، تلفيق، و كيوريجين هيبتون ميكروأرس هيستون لتوليد ملامح خصوصية للأجسام المضادة التي تعترف هيستونيس و بتمس بهم. ويسهل خط الأنابيب من قبل أرينينيا، مفتوح المصدر، وتطبيق البرمجيات التفاعلية التي قمنا بتطويرها مؤخرا، والذي يدمج مراحل التصميم والتحليل من التجارب ميكروأري 28 . تعمل أرينينيا بشكل أفضل في غوغل كروم. باختصار، يتم استخدام طابعة ميكروأري الاتصال الروبوتية لإيداع مكتبة من البيوتين هيتون الببتيدات مترافق البيوتين في مواقف محددة على شرائح المجهر الزجاج ستريبتافيدين المغلفة. صفائف يمكن بعد ذلك أن تستخدم في شكل مقايسة تنافسية ومتوازية لاستجواب التفاعلات الأجسام المضادة-حاتمة ( الشكل 1 ). تتكون مكتبة الببتيد من مئات من الببتيدات الاصطناعية الفريدة التي تؤوي بتمس (ليسين أسيتيلاتيون، ليسين / أرجينين مثيلة، و سيرين / ثريونين فسفوريلاتيون) وحدها وفي توليفات ذات صلة مستمدة إلى حد كبير من مجموعات بروتيوميكس. طرق لتوليف الببتيد والتحقق من صحة<html> مفصلة في مكان آخر 23 . يتم تخزين البيانات التي تم إنشاؤها من جهودنا الحالية هيستون بتم الكشف عن الأجسام المضادة باستخدام هذه المنصة مجموعة على الموارد على شبكة الإنترنت العامة، وهيستون هيتيون الأجسام المضادة قاعدة بيانات (www.histoneantibodies.com). ومن الجدير بالذكر أن هيستون الببتيد ميكروأرس ملفقة مع الاختلافات من هذا البروتوكول كما استخدمت على نطاق واسع لتوصيف نشاط هيستون بتم القارئ المجالات 8 و 29 و 30 و 31 و 32 و 33 و 34 و 35 و 36 و 37 ومؤخرا إلى ملف هيستون بتم الكاتب و الممحاة الأنشطة 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1: رسم كاريكاتوري من الإجراء تدريجي لفحص الأجسام المضادة على هيستون الببتيد ميكروأري. الببتيدات هيستون البيروكسيديز الإيواء تعريف التعديلات بعد متعدية (الدوائر الحمراء والزرقاء) هي شارك في طباعة مع البيوتين فلوريسئين على الزجاج المغلفة ستريبتافيدين. يتم تصور التفاعلات الإيجابية كما مضان أحمر. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table><tbody><tr><td>صفيف الطباعة العازلة</td><td>PPB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Omnipure</td><td>2390</td><td></td></tr> شرائح <tr><td>مجهر زجاجي مطلي بالستربتافيدين Greiner</td><td>Bio-one</td><td>439003-25</td><td></td></tr><tr><td>مادة البولي بروبيلين 384 لوحة البئر</td><td>Greiner Bio-one</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>البيوتين والفلورسين</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td></td></tr><tr><td>طابعة المصفوفات الدقيقة</td><td>Aushon</td><td>2470</td><td>Aushon 2470 طابعة Microarray</td></tr><tr><td>الاتصال طابعة المصفوفات الدقيقة</td><td>آلات الجينات</td><td>OmniGrid 100</td><td>OmniGrid Microarray</td></tr><tr><td>Printer PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer</td><td>ArrayIt</td><td>SBB</td><td></td></tr><tr><td>قلم الشمع الكارهة للماء</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge حاجز مسعور PAP القلم</td></tr><tr><td>السيليكون حشية</td><td>Grace Bio-labs</td><td>622511</td><td></td></tr><tr><td>وعاء التهجين</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td>أو وعاء مماثل</td></tr><tr><td>للأجسام المضادة الثانوية المترافقة بصبغة الفلورسنت</td><td>Life Technologies</td><td>A-21244</td><td>Alexa Fluor 647 (مضاد للأرانب)</td></tr> <tr><td>الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بصبغة الفلورسنت</td><td>Life Technologies</td><td>A-21235</td><td>Alexa Fluor 647 (مضاد للماوس)</td></tr> <tr><td>الشمع Imprinter</td><td>ArrayIt</td><td>MSI48</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Omnipure</td><td>9490</td><td></td></tr><tr><td>Microarray Scanner</td><td>InnoScan</td><td>1100AL</td><td>أو ما يعادلها من الماسح الضوئي المصفوفات الدقيقة</td></tr><tr><td>EipTitan Histone Peptide Microarray</td><td>Epicypher</td><td>112001</td><td></td></tr><tr><td>AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td><td>Millipore</td><td>16668</td><td></td></tr><tr><td>MODified Histone الببتيد صفيف</td><td>نشط الشكل</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>هيستون كود الببتيد المصفوفات الدقيقة JPT</td><td></td><td>His_MA_01</td><td></td></tr><tr><td>الشمع</td><td>رويال أوك</td><td>الخليالشمع</td><td>لطابعة الشمع</td></tr><tr><td>المرطب Microarray الشرائح التهجين غرفة</td><td>VWR</td><td>97000-284</td><td></td></tr><tr><td>عالية الإنتاجية المجهر غرفة غسيل الشريحة</td><td>ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td>المجهر جهاز طرد مركزي منزلق</td><td></td><td>VWR 93000-204</td><td></td></tr><tr><td>جسم مضاد 1</td><td>Abcam</td><td>8898</td><td></td></tr><tr><td>جسم مضاد 2</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>ببتيد هيستون بيوتينيل</td><td>EpiCypher</td><td>12-0001</td><td>مثال على الببتيد. تتوفر ببتيدات مماثلة مع تعديلات مختلفة من عدة مصادر تجارية.</td></tr><tr><td>ImageMagick</td><td></td><td></td><td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td></tr><tr><td>ArrayNinja</td><td></td><td></td><td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td></tr></tbody></table>

تحليل هيستون الأجسام المضادة خصوصية مع ميكروأرس الببتيد

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

يتم دراسة التعديلات بعد متعدية (بتمس) على البروتينات هيستون على نطاق واسع لدورها في تنظيم هيكل الكروماتين والتعبير الجيني. وقد سهل الإنتاج الضخم وتوزيع الأجسام المضادة المحددة ل هيستون بتمس إلى حد كبير البحث على هذه العلامات. كما هيستون الأجسام المضادة بتم هي الكواشف الرئيسية للعديد من الكروماتين تطبيقات الكيمياء الحيوية، تحليل دقيق للخصوصية الأجسام المضادة ضروري لتفسير البيانات دقيقة والتقدم المستمر في هذا المجال. يصف هذا البروتوكول خط أنابيب متكامل لتصميم وتصنيع واستخدام ميكروأرس الببتيد لتنميط خصوصية الأجسام المضادة هيستون. يتم تسهيل جوانب التصميم والتحليل من هذا الإجراء من قبل أرينينيا، مفتوحة المصدر وتفاعلية حزمة البرامج التي قمنا بتطويرها مؤخرا لتبسيط تخصيص صيغ الطباعة ميكروأري. وقد استخدمت هذه الأنابيب لفحص عدد كبير من المتاحة تجاريا وتستخدم على نطاق واسع هيستون بتم أنتيبوديs، والبيانات التي تم إنشاؤها من هذه التجارب متاحة بحرية من خلال قاعدة بيانات خصوصية هيستون الأجسام المضادة على الانترنت وتوسيعها. ما وراء الهستونات، المنهجية العامة الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على نطاق واسع لتحليل الأجسام المضادة بتم محددة.

وقد تم استخدام هذا البروتوكول لتصميم وتصنيع منصة ميكروأري الببتيد لتحليل هيستون بتم الضد خصوصية. الصفيف يستعلم مكتبة من أكثر من 300 ميزات الببتيد فريدة من نوعها (20 - 40 بقايا في الطول) تمثل العديد من مجموعات معروفة من بتمس وجدت على الأساسية والبروتينات هيستون البديل 38 . وقد كان هذا خط أنابيب العمود الفقري لفحص العديد من الأجسام المضادة هيستون بتم المستخدمة على نطاق واسع والمتاحة تجاريا، ومجموعات البيانات الكاملة متوفرة على...

تصف هذه المخطوطة طرق لتطبيق تقنية ميكروأري الببتيد على التنميط خصوصية الأجسام المضادة التي تعترف هيستونيس والتعديلات بعد متعدية لها.

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

الهدف من هذا الفيديو هو وصف مسار عمل متكامل لتصميم وتصنيع واستخدام المصفوفات الدقيقة الببتيدية لتحديد خصوصيات أجسام مضادة للهيستون. تعد الأجسام المضادة التي تتعرف على الهيستونات وتعديلاتها المتنوعة ما بعد الترجمة كواشف أساسية في أبحاث الكيمياء الحيوية للكروماتين. ونحن نعتمد على هذه الأدوات لتعميق فهمنا لوظيفة تعديلات الهيستون.تكشف الدراسات الحديثة عن وجود تضاربات في سلوك الأجسام المضادة للهيستون. وبما أن اختيار الجسم المضاد هو العنصر الأكثر أهمية في تجارب علم فوق الجينات، فإن هناك حاجة ملحة لتدابير رقابة جودة شاملة وصارمة لهذه الكواشف. نوضح هنا مسار عمل متكاملاً قمنا بتطويره لتصميم وتصنيع وتحليل المصفوفات الدقيقة الببتيدية لإنشاء ملفات تعريف الخصوصية للأجسام المضادة التي تتعرف على الهيستونات وتعديلاتها ما بعد الترجمية.يتم تسهيل مسار العمل بواسطة Array Ninja، وهو تطبيق برمجِي تفاعلي مفتوح المصدر قمنا بتطويره، يدمج مراحل التصميم والتحليل لتجارب المصفوفات الدقيقة. لبدء تصميم شريحة المصفوفة، من تحت عنوان تخطيط الشريحة، اختر طابعة المصفوفات الدقيقة التي سيتم استخدامها. بعد ذلك، اكتب empty في حقل تحميل اللوحة واضغط على enter.اضبط قطر البقعة على 275 micrometers والمسافة بين البقع على 100 micrometers. املأ المعلمات المتبقية بما يتناسب مع التجربة، مع التأكد من أن المخطط يسمح بعدد كافٍ من المكررات. في معاينة المخطط الناتجة، مرر مؤشر الماوس فوق كل سمة ببتيدية فريدة على الشريحة وأدخل معرف السمة في مربع النص المنبثق.بمجرد تسمية كل ميزة فريدة، انقر فوق populate. قم بتسمية تخطيط الشريحة، ثم انقر فوق commit your plate لحفظ التخطيط وإنشاء خريطة للمواقع الفيزيائية لكل ميزة في الأطباق المصدر. وبالاسترشاد بخريطة الطبق المصدر، قم بتحميل 1 إلى 2 µL من كل ميزة ببتيدية في الآبار المخصصة في طبق واحد أو أكثر من أطباق 384 wells ذات الحجم الصغير، ثم خفف كل ميزة بمقدار 10 أضعاف باستخدام 1x protein microarray printing buffer، مدعماً بـ 1% bovine serum albumin و 5 µg/µL من fluorescin labeled biotin.بعد ذلك، يتم إجراء طرد مركزي للأطباق عند 500 x G في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. ثم، أفرغ حاوية النفايات في طابعة المصفوفات الدقيقة. املأ حاويات المرطب بمحلول الغسيل باستخدام ماء مقطر معقم.أدخل معاملات شريحة المصفوفة في برنامج طابعة المصفوفات الدقيقة. اضبط إجراء الغسل على غسلة واحدة لمدة ثانية واحدة باستخدام الغمر الفردي، والغسل البعدي على إعادة غمس المسامير خمس مرات، والرطوبة على 60%. بعد ذلك، أدخل الشرائح الزجاجية المطلية في منصات الركيزة. حمّل المنصات في مصعد المنصات.أدخل ألواح المصدر في حاملات الألواح ثم حمّل الحاملات في مصعد ألواح المصدر. قم بتشغيل عملية الطباعة، ثم أخرج شرائح البلاتين الركيزة من الجهاز. قم بحجب الشرائح المطبوعة باستخدام 1x protein microarray blocking buffer لمدة 30 دقيقة مع الرج.بعد ذلك، تُغسل الشرائح في محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) بدرجة حموضة pH 7.6 في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تُكرر عملية الغسل باستخدام دفعة جديدة من محلول PBS. ثم تُجفف الشرائح عن طريق الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، قم بتسخين طابعة شمع المصفوفات الدقيقة مسبقاً عند 85 degrees celsius لمدة 30 دقيقة، أو حتى ينصهر الشمع. ثم، أدخل شريحة بحيث يكون الجانب المطبوع متجهاً للأسفل في الحامل، وقم بمحاذاة الحامل مع قالب الطابعة. اجعل القالب يلامس الشريحة وثبته لمدة ثانيتين، ثم قم بإزالة الشريحة بسرعة من الحامل وافحص حدود الشمع للتأكد من إحاطة المصفوفات بشكل صحيح.تُحفظ الشرائح المقسمة عند درجة حرارة 4 °C، في منطقة جافة ومظلمة. لبدء إجراء التهجين، ضع شريحة مصفوفة مقسمة في وعاء بلاستيكي وقم بتغطية الشريحة بمحلول التهجين المنظم. اترك الشريحة لتتوازن لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، مع الرج بسرعة منخفضة.قم بتجفيف الشريحة عن طريق تدويرها في جهاز طرد مركزي لشرائح المصفوفات الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف 5 µL من محلول كل جسم مضاد لـ histone PTM إلى بئرَين على الأقل من المصفوفة، ثم قم بالتحضين عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة. بعد التحضين، قم بإزالة محلول الجسم المضاد واغسل المصفوفة باستخدام PBS بارد ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة عند درجة حرارة 4 °C.بعد ذلك، يتم تحضين المصفوفة في محلول جسم مضاد ثانوي مقترن بصبغة فلورية. لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية، في غياب الضوء. يتم غسل الشريحة ثلاث مرات باستخدام PBS بارد كما سبق.اغمر المصفوفة في محلول PBS بتركيز 0.1x في درجة حرارة الغرفة لإزالة الملح الزائد، ثم جفف الشريحة عن طريق إجراء عملية طرد مركزي قصيرة في درجة حرارة الغرفة. قم بتصوير الشريحة باستخدام ماسح المصفوفات الدقيقة بدقة لا تقل عن 25 microns. لبدء التحليل، استخدم برنامج معالجة الصور لدمج ملفات القنوات الفردية الناتجة عن ماسح المصفوفات الدقيقة.بعد ذلك، افتح برنامج Array Ninja واختر طابعة المصفوفات الدقيقة المناسبة تحت عنوان "to quantify images". أدخل اسم مخطط الشريحة ذاته في مربع حوار "load plate"، ثم اضغط enter. قم بتحميل ملف الصورة المدمجة، واضبط التباين والسطوع والنقطة المتوسطة حسب الرغبة.أدخل دقة ماسح المصفوفة، واضبط الهوامش العلوية والجانبية لمحاذاة شبكة تخطيط الشريحة مع الصورة. لتحليل مجموعة من الآبار كمكررات أو لإجراء تحليل انتقائي آخر، أدخل إحداثيات البئر في حقول iPin وjPin وsubA ثم اضغط enter. انقر لتبديل التكبير، لعرض صورة مكبرة للمنطقة الموجودة تحت المؤشر.بعد ذلك، انقر فوق "spot seek" وانتظر حتى تكتمل العملية. كرر وظيفة البحث حسب الحاجة لتوسيط دوائر الشبكة على بقع المصفوفة. يمكن تحديد البقع المرجعية بالضغط على مفتاح R، كما يمكن إلغاء تنشيط البقع التي تظهر فيها شوائب أو تظهر مورفولوجيا متباعدة بالضغط على مفتاح A أثناء التمرير فوق البقعة.بمجرد اختيار بقع المرجعية للخلفية، وتعطيل البقع التي تظهر فيها مورفولوجيا المسام أو التلوث، انقر فوق populate، ثم submit لإجراء القياس الكمي. سيتم عرض رسم بياني شريطي وجدول في صفحة جديدة. تم تقييم خصوصيات الارتباط لاثنين من الأجسام المضادة لتعديلات ما بعد الترجمة (PTM) للهيستون باستخدام هذه الطريقة.وُجِد أيضًا أن جسمًا مضادًا لتعديل ما بعد الترجمة (PTM) للهيستون، مصمم لاستهداف الليزين 9 ثلاثي الميثيل في الهيستون H3، يرتبط بثلاث مجموعات ليزين ثلاثية الميثيل أخرى. كما لوحظ أن عملية السيللة (silylation) لبقايا الليزين المجاورة تؤثر إيجابًا على استهداف الليزين 9 في H3. أما الجسم المضاد لتعديل ما بعد الترجمة (PTM) للهيستون الذي يستهدف الليزين 4 ثلاثي الميثيل في الهيستون H3، فقد وُجِد أنه يتفاعل أيضًا مع الليزين 4 أحادي الميثيل وثنائي الميثيل في H3. ولوحظ في هذا المقايسة أن فسفرة الأننين 6 (anine six) الثلاث المجاورة تؤثر سلبًا على الارتباط بالليزين 4.لقد استُخدم مسار العمل هذا لفحص العديد من الأجسام المضادة للهستونات الأكثر شيوعاً والمتاحة تجارياً، والبيانات الناتجة عن هذه التجارب متاحة مجاناً من خلال قاعدة بيانات خصوصية الأجسام المضادة للهستونات. وقد وُصِفت سابقاً تعديلات على مسار العمل هذا لتحليل قارئات الهستونات وكتاباتها ومماحاتها، كما يمكن تعديل هذه المنصة بسهولة لأي مكتبة قابلة للطباعة تثير الاهتمام قبل استخدامها في مجالات تتجاوز أبحاث علم فوق الجينات. تتوفر تجارياً عدة منصات للمصفوفات الدقيقة لببتيدات الهستونات للمستخدمين الذين لا يملكون إمكانية الوصول إلى المعدات المتخصصة المطلوبة لتخليق الببتيدات وتصنيع المصفوفات.

analysis-of-histone-antibody-specificity-with-peptide-microarrays

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

في هذه الدراسة، فإننا وصف بروتوكول محسن لميكروأري المضاعفة الأجسام المضادة عالية الإنتاجية مع طريقة كشف كتين التي يمكن استخدامها في التنميط ارتباط بالغليكوزيل من بروتينات محددة. يتميز هذا البروتوكول الكواشف موثوق جديدة ويخفف كثيرا من الوقت والتكلفة، ومتطلبات معدات مختبر بالمقارنة مع الإجراء السابق.

كيميائيا سدت [ميكروأري] لتحديد ملامح عالية الإنتاجية من تعدد في الإرسال ارتباط بالغليكوزيل بروتين معين في عينات مجمع

يوضح هذا الفيديو تقنية تطبق تقنية المصفوفات الدقيقة للببتيد لتعريف خصوصية الأجسام المضادة التي تتعرف على التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) على ببتيدات الهيستون. يتم التعامل مع شريحة المصفوفة الدقيقة التي تحتوي على ببتيدات هيستون مترافقة بالفلوروفور مع مجموعات PTM المعروفة بالأجسام المضادة المستهدفة الخاصة ب PTM. تساعد هذه العملية في تحديد خصوصية الجسم المضاد للهدف وتفاعله المتبادل المحتمل مع PTMs غير المستهدفة.

تقنية المصفوفة الدقيقة للببتيد لتنميط خصوصية الأجسام المضادة

من خلال الجمع بين الأم ويشابك مناعي لونين مع عالية الدقة الطيف الكتلي، نهج ChroP تمكن من تشريح بنية البروتين المركب من التعديلات هيستون، المتغيرات والبروتينات غير histonic التآزر في المجالات ونين متميزة وظيفيا.

النهج ChroP يجمع بين الشذرة والطيف الكتلي لتشريح المناظر الطبيعية البروتيومية الحالة رقم محدد من الكروماتين

يمكن فحوصات البيوكيميائية مع المؤتلف الإنسان جزيئات MHC II تقديم سريع، رؤى الكمي في تحديد حاتمة المناعية، الحذف، أو التصميم. هنا، يوصف مقايسة ملزمة الببتيد-MHC II تحجيم لوحات 384 جيدا. هذا الشكل فعالة من حيث التكلفة يجب أن تكون مفيدة في مجالات deimmunization البروتين وتصميم لقاح والتنمية.

A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم

فحص مصفوفة الببتيد هو اختبار عالي الإنتاجية لتحديد مواقع تفاعل البروتين والبروتين. يسمح ذلك برسم خرائط للتفاعلات المتعددة للبروتين المستهدف ويمكن أن يكون بمثابة طريقة لتحديد مواقع المثبطات التي تستهدف البروتين. نصف هنا بروتوكولا لفحص وتحليل مصفوفات الببتيد.

تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف

أصبحت طرق رسم خرائط تفاعلات البروتين والحمض النووي في الجسم الحي حاسمة لكل جانب من جوانب البحث الجينومي ولكنها شاقة ومكلفة وتستغرق وقتا طويلا. هنا يتم تقديم نظام روبوتي لمعالجة السوائل المتاح تجاريا يعمل على أتمتة الترسيب المناعي للكروماتين لرسم خرائط تفاعلات البروتين والحمض النووي في الجسم الحي مع كميات محدودة من الخلايا.

أتمتة التجارب رقاقة وما يليها لتوليد الملامح جينية على خلايا هيلا 10،000

يمكن استخدام  مصفوفات الببتيد المركبة بطريقة SPOT لتحليل خصوصية الركيزة لبروتين ليسين ميثيل ترانسفيراز (PKMTs) ولتحديد طيف الركيزة ل PKMTs لفهم دورها البيولوجي. يصف هذا البروتوكول كيفية تصنيع مصفوفات الببتيد ، وميثيليتها باستخدام PKMTs ، وتحليل النتائج.

تحليل خصوصية البروتين ليسين ميثيل عن طريق SPOT الببتيد صفائف

هنا ، يقدم المؤلفون بروتوكولا بسيطا وفعالا لتحديد حاتمة مستضدية خطية باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة منقى ومسح الببتيد من خلال تهجين اللطخة النقطية. يمكن بعد ذلك استخدام الحاتمة المحددة في التطبيقات العلاجية والتشخيصية.

تحديد حاتمة الخطي B-خلية المعترف بها الأجسام المضادة وحيدة النسيلة-الببتيد الضوئي بمساعدة

عدم التطابق في الكريات البيض البشرية مستضد (هلا) تسلسل بين الهيئة المانحة والمتلقية أزواج هي السبب الرئيسي للرفض بوساطة الأضداد في زرع الأعضاء. نقدم هنا استخدام صفائف مستضد مخصصة تستند إلى هلا تسلسلات فرادى المانحين للتحقيق المضادة المانحين هلا اللوانتيبوديس في الجهاز المتلقين.

تخصيص صفائف الببتيد للكشف عن Alloantibodies هلا في زرع الأعضاء

هنا ، نقدم بروتوكولا لتنقية مجمعات الببتيد من الفئة الأولى والثانية من MHC من خطوط الفئران والخلايا البشرية التي توفر بيانات عالية الجودة عن الببتيدوميكا المناعية. ويركز البروتوكول على تحضير العينات باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا.

الببتيدات المناعية: عزل الفأر والببتيدات البشرية المرتبطة بالفئران MHC من الفئتين الأولى والثانية لتحليل الطيف الكتلي

تم مؤخرا تحديد متغيرات جينية في عضو عائلة سبيندلين البشري 4 (SPIN4) لدى مرضى يعانون من فرط نمو العظام، وهو اضطراب تطوري جديد. تم تقديم بروتوكول ونتائج جديدة تصف التعرف الكيميائي الحيوي للهستونات المعدلة في سياق النيوكليوسومات كركائز ارتباط SPIN4.

تحديد الهيستونات المعدلة كركائز ارتباط لعضو عائلة سبيندلين البشري 4 (SPIN4) بواسطة مصفوفات الببتيدات وسحب النيوكليوسوم الأصلي

اكتشف خطوط أنابيب متكاملة لتصميم وتحليل مصفوفات الببتيد لتحديد خصوصية أجسام مضادة الهيستون في أبحاث الكروماتين. تعزز هذه الطريقة موثوقية التحكم في جودة الأجسام المضادة للدراسات الوراثية.

تحليل هيستون الأجسام المضادة خصوصية مع ميكروأرس الببتيد

استكشف المزيد من الفيديوهات