نهج موحد لتنقية مولتبيسيسيز من الثدييات خلايا الجرثومية الذكور من الأنسجة الميكانيكية التفكك والتدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء الموحد هو عزل أنواع الخلايا الجرثومية الذكرية المتميزة من أنواع الثدييات المختلفة باستخدام بروتوكول واحد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تسهيل الدراسة الجزيئية لتكوين المنوية من خلال التحليل عالي الإنتاجية لأنواع الخلايا الجرثومية المختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تطبيق مجموعة واحدة من الكواشف على أنواع الثدييات المختلفة للعزل المتزامن لأربعة مجموعات مختلفة من الخلايا الجرثومية الذكرية.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قررنا التحقيق في تطور أنماط محددة من تنظيم التعبير الجيني في الثدييات المختلفة. سيوضح كريس هولي ، وهو تقني طبي من Siteman Flow Cytometry Core ، كيفية تشغيل فارز الخلايا وضبط البوابات. ابدأ بفك كبسولة خصية فأر واحدة وتقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة.

ثم استخدم الملقط لنقل قطع الأنسجة الصغيرة إلى خرطوشة تفكيك الأنسجة المبللة مسبقا بحجم 50 ميكرومتر. أضف ملليلتر واحدا من وسيط DMEM إلى الخرطوشة ، وقم بتحميل خرطوشة تفكيك الأنسجة على نظام تفكيك الأنسجة. أدر المقبض من وضع الاستعداد إلى التشغيل ، وقم بمعالجة الأنسجة لمدة خمس دقائق.

ثم قم بإزالة الخرطوشة ، واستخدم حقنة يمكن التخلص منها سعة ثلاثة ملليلتر لشفط تعليق الخلية من منفذ المحقنة. عندما يتم استرداد كل السائل ، قم بتصفية الخلايا من خلال مرشحين فرديين ، التخلص ، مبلل مسبقا 40 ميكرومتر لإزالة أي مجاميع خلية ، وإعادة التعليق إلى خرطوشة التفكيك. ثم قم بمعالجة الخلايا لمدة خمس دقائق أخرى.

لتلطيخ الخلايا لفرز الخلايا التي يتم تنشيطها بالفلورة ، اجمع معلق الخلية المنفصل في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. ثم انقل 150 ميكرولترا من الخلايا إلى كل من الأنابيب الثلاثة الجديدة سعة 1.5 ملليلتر ، مع إضافة الحجم المتبقي إلى أنبوب رابع سعة 1.5 مل. إذا تركنا الأنبوب الأول جانبا كعنصر تحكم غير ملوث، أضف 2.5 ميكرولتر من Hoechst إلى الأنبوب الثاني، وميكرولتر واحد من يوديد البروبيديوم إلى الأنبوب الثالث، وكل من Hoechst و بروبيديوم يوديد إلى الأنبوب الرابع.

بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع دوران لطيف ، قم بتصفية معلقات الخلية من خلال مصافي فردية مبللة مسبقا 40 ميكرون إلى أنابيب مستديرة القاع سعة خمسة ملليلتر. بعد ذلك ، ضع أربعة أنابيب تجميع تحتوي على DMEM مكملة ب FBS تحت صنبور الفرز لمقياس التدفق الخلوي ، وقم بتحميل أنبوب التحكم غير الملوثة للتحليل. استخدم مخطط مبعثر أمامي مقابل جانبي لاستبعاد حطام الخلية ، واضبط عتبة التشتت الأمامي وعرض النبضة للسماح ببوابة الخلايا المفردة.

البوابات الصارمة أمرا بالغ الأهمية لتحسين جودة العينة التي تم جمعها. تأكد من اختيار الخلايا المفردة عن طريق استبعاد الحطام الخلوي والمجاميع متعددة الخلايا. استخدم الخلايا أحادية اللون لتحديد عتبة شدة مضان Hoechst و propidium iodide فيما يتعلق بالعينة غير الملطخة.

ثم قم بتحميل العينة التجريبية ذات الصبغة المزدوجة ، واضبط البوابات الرئيسية الثلاثة كما هو موضح للتو. عندما يتم تعيين البوابات الأصلية الثلاث ، حدد الخلايا الحية بناء على افتقارها إلى تلطيخ يوديد البروبيديوم ، واضبط محتوى الحمض النووي عن طريق رسم رسم بياني لعدد الخلايا بناء على مضان Hoechst الأزرق. قم بتعيين بوابة لكل من القمم الثلاث لزيادة تركيز التألق الأزرق Hoechst ، والتي تمثل الخلايا أحادية الصيغة الصبغية ، ثنائية الصبغيات ، ورباعية الصبغيات ، ولاحظ ما لا يقل عن 500،000 حدث على مخطط التشتت الأمامي مقابل الجانبي.

ارسم الخلايا السلبية لليوديد البروبيديوم وفقا لشدة التألق الأزرق والأحمر. ستظهر المنوية كمجموعة جانبية. ترتبط شدة التألق الأزرق Hoechst بمحتوى الحمض النووي.

لذلك ، فإن ضبط هذه البوابة قبل إنشاء مخططات Hoechst الزرقاء والحمراء يضمن اختيار الخلايا ذات الصيغة الصبغية المطلوبة. لعزل المنوية ، قم ببوابة الذروة أحادية الصيغة الصبغية وحدد المجموعة التي تظهر عند رسم مضان Hoechst الأزرق والأحمر. لعزل الخلايا المنوية II ، قم ببوابة الذروة ثنائية الصبغيات وحدد المجموعة التي تظهر عند رسم مضان Hoechst الأزرق والأحمر.

بالنسبة للخلايا المنوية I عزل ، قم ببوابة ذروة رباعي الصبغيات وحدد السكان الذين يظهرون عند رسم مضان Hoechst الأزرق والأحمر. ثم قم بفرز المجموعات السكانية الفرعية المحددة في أنابيب التجميع الفردية لجمع ما يقرب من 0.5 إلى ستة في 10 إلى الخلايا الست لكل مجموعة فرعية من الخلية. تظهر معلقات الخلايا التي تم الحصول عليها عن طريق التفكك الميكانيكي للأنسجة الطازجة غير الملوثة أو الملطخة ب Hoechst وجود خلايا مفردة في مراحل مختلفة من التمايز.

الأهم من ذلك ، يبدو أن الهياكل الخلوية محفوظة ، بما في ذلك سوط المنوية. بعد استبعاد الحطام الخلوي ، يتم انفراد 95 إلى 98٪ من الخلايا ، 86 إلى 93٪ منها على قيد الحياة. يسهل رسم وظيفة مضان Hoechst الأزرق الأحمر أثناء FACS تحديد مجموعات الخلايا الجرثومية الخصية المحددة.

كما هو متوقع ، فإن مجموعة المنوية أحادية الصيغة الصبغية هي الأكثر وفرة ، تليها خلايا المنوية ثنائية الصبغيات الثانية والخلايا المنوية الأولية رباعية الصبغيات ، وهو نمط يتم الحفاظ عليه عبر الأنواع. يكشف التحليل المجهري للخلايا التي تم فرزها أن المنوية تظهر كروماتين متغاير متميز وصغير ومستدير وحول المركز يصبغ بشكل مشرق ل Hoechst. الخلايا المنوية هي خلايا حبيبية أكبر حجما ذات نوى يمكن التعرف عليها بسهولة تظهر اختلافات كروماتين مميزة للخلايا الانتصافية في المجموعات السكانية الفرعية للخلايا المنوية الأولى وبواسطة النوى ذات النواة أو الحركية في المجموعات السكانية الفرعية للخلايا المنوية الثانية.

المنوية عبارة عن خلايا أحادية الصيغة الصبغية صغيرة ذات شكل دائري أو ممدود يمكن تمييزها عن المنوية من خلال وجود مراكز كروموكورية موضعية. يمكن إتقان هذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن Hoechst شديد الحساسية وسام للجينات وأن دقة مجموعات الخلايا يمكن تحسينها من خلال فترات حضانة أطول حسب الحاجة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق omics عالية الإنتاجية للإجابة على الأسئلة المتعلقة بالتعديلات اللاجينية أو النسخ ووفرة البروتين وتنوعه داخل أنواع الثدييات في سياق تطوري. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا التناسلية للذكور لاستكشاف الآليات التنظيمية التي تقود تطور تكوين المنوية في العديد من أنواع الثدييات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية معالجة عينات الخصية ل Hoechst FACS وكيفية تحديد وعزل أنواع الخلايا الجرثومية الذكرية المختلفة بناء على إشارة Hoechst الخاصة بهم.

يمكن أن تكون الأصباغ المرتبطة بالحمض النووي مثل Hoechst و propidium iodide خطيرة للغاية. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع هذه الكواشف.