عزل ميوبلاستس الإنسان، تقييم التمايز العضلي، وقياس دخول الكالسيوم التي تديرها المخازن

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على مجموعة نقية من الأرومات العضلية البشرية من عضلات الهيكل العظمي البالغة. تستخدم هذه الخلايا في الدراسات الوظيفية مثل تقييم التمايز العضلي وقياس دخول الكالسيوم الذي يتم تشغيله في المتجر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بعزل سريع وبسيط وقابل للتكرار للأرومات العضلية الأولية البشرية.

هذه الأرومات العضلية هي الخارج الجديد من الجسم الحي لدراسة إشارات الكالسيوم أثناء تجديد العضلات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العضلات مثل تحديد القنوات الأيونية وعوامل النسخ المتضمنة أثناء تمايز العضلات. لهذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لوظائف الجينات أثناء التمايز العضلي البشري.

يمكن أيضا تطبيقه على دراسات أخرى مثل, إمكانية استخدام الخلايا الجذعية العضلية لعلاج ضمور العضلات. انقل عينة العضلات إلى صفيحة معقمة بحجم ستة سنتيمترات ، واغسل العينة باستخدام PBS مرتين. قم بإزالة أي أنسجة دهنية متبقية وقم بوزن العينة.

بعد ذلك ، أضف التربسين وفرم العضلات إلى قطع أصغر من ملليمترين في الحجم. بمجرد فرمها ، استخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لنقل الأنسجة إلى زجاجة تفكك سعة 200 مل تحتوي على قضيب تقليب ، ثم استمر في جمع الأنسجة المفرومة في محلول التربسين حتى تمتلئ زجاجة التفكك إلى 90 ملليلترا. الآن ، احتضن الأنسجة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة مع التحريك اللطيف.

بعد ساعة ، أضف 10 ملليلتر من FCS لإيقاف التفاعل وتجانس الخليط باستخدام التخلي. الآن ، قم بتحميل مصافي 70 ميكرون على أنبوبين سعة 50 مليلتر وقم بتمرير نصف تعليق الخلية عبر كل مصفاة عن طريق سحب التعليق في المرشحات. بعد ذلك ، قم بعمل تعليق للخلايا في وسط النمو ولوحة 200،000 خلية على ألواح ستة سنتيمترات مع أربعة ملليلتر من المتوسط.

احتضن الألواح ، وتغيير الوسط كل ثلاثة أيام. بعد خمسة إلى سبعة أيام ، يجب أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 70٪ إلى 80٪ ، ثم تلطخها. للبدء ، اشطف لوحة الخلايا المتقاربة باستخدام PBS.

ثم أضف ملليلترا واحدا من محلول التربسين واترك الإنزيم يعمل لمدة ثلاث دقائق. أوقف التفاعل بإضافة ملليلترين من الوسط واجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 ملليلترا. ثم قم بتدوير الخلايا لأسفل وأعد تعليقها في مليلتر واحد من المتوسط.

بعد ذلك ، خذ عدد الخلايا أثناء تخزين الخلايا على الجليد. لتحليل الحقائق ، قم بتحميل سبعة أنابيب بها 100 ، 000 خلية لكل منها. قم بتحميل الخلايا المتبقية في أنبوب ثامن للفرز.

اغسل الخلايا بملليلتر واحد من المخزن المؤقت للفاكس البارد ، ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب والشفط والتخلص من المادة الطافية. أضف 200 ميكرولتر من مخزن الفاكس المؤقت مع الأجسام المضادة المناسبة واترك الخلايا تحتضن على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، اغسل الخلايا مرة أخرى وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس ، ثم قم بفرز الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

بعد استبعاد الخلايا المكونة للدم CD45 الإيجابية ، افصل الخلايا السالبة CD45 بناء على تعبير CD56. بعد ذلك ، قم ببوابة السكان الإيجابيين CD56 ل CD34 و CD144 و CD146. أعد تحليل جزء صغير من السكان الذين تم فرزهم للتحقق من النقاء.

الآن ، اسحب الأرومات العضلية البشرية واغسلها بخمسة ملليلتر من المتوسط. ثم أعد تعليقها في مليلتر واحد من المتوسط. انقل التعليق إلى صفيحة يبلغ طولها ستة سنتيمترات مع أربعة ملليلتر من الوسط واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 7٪ ثاني أكسيد الكربون.

لهذا الإجراء ، قم بزراعة الأرومات العضلية وقم بعمل وسط نقل جديد. احتضان الوسط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة. أثناء الحضانة المتوسطة ، قم بإعداد الأرومات العضلية.

أولا ، اشطفها مرة واحدة باستخدام PBS. ثم قم بالتربسين للخلايا الملتصقة. أوقف التفاعل بإضافة ملليلترين من المتوسط.

ثم اجمع الخلايا في أنبوب سعة 50 ملليلترا. قم بتدويرها وإعادة تعليقها في مليلتر واحد من المتوسط. لكل عملية نقل ، قم بإعداد 500 ، 000 خلية في 200 ميكرولتر من المتوسط.

لكل 500 ميكرولتر من وسط الحمل ، أضف 200 ميكرولتر من الخلايا ثم امزجها باستخدام ضربتين فقط من مسدس الماصة. ثم اترك التفاعلات تستمر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد خمس دقائق ، انقل التفاعلات إلى أطباق استزراع 3.5 سم ، يحتوي كل منها على زلة غطاء زجاجي واحدة.

بعد ذلك ، أضف 1.3 مل من الوسط للحصول على حجم نهائي يبلغ ملليلترين واحتضان الأطباق. بعد 48 ساعة من التمايز ، يمكن تلطيخ الخلايا مناعية أو تحليلها باستخدام تصوير الكالسيوم. لأي من الخيارين ، اغسل الخلايا أولا بعناية مرتين باستخدام ملليلتر واحد من PBS بدرجة حرارة الغرفة لغسلها.

حاول تجنب فصل الأنابيب العضلية. للحصول على تصوير الكالسيوم ، قم بتغطية الخلايا المغسولة باثنين من micromolar fura-2 AM بالإضافة إلى حمض ثريونيك ميكرومولار واحد في وسط يحتوي على الكالسيوم. ثم اتركهم يحتضنون لمدة 30 دقيقة قبل الخلط.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين بوسط يحتوي على الكالسيوم غير المعدل ثم احتضنها لمدة 10 إلى 15 دقيقة للأسترة. الآن ، قم بإزالة زلة الغطاء من لوحة الثقافة وقم بتثبيتها في الغرفة التجريبية. قم بتحميل الغرفة بوسط يحتوي على الكالسيوم ، وضعها تحت المجهر ، ثم ابدأ تسجيل البيانات.

Fura-2 متحمس بالتناوب عند 340 و 380 نانومتر. يتم جمع ضوء الانبعاث عند 510 نانومتر. يوفر الغوص في الصور النانومترية 340 نانومتر بواسطة 380 صورة نسب الصورة حيث أن التقلبات وتركيز الكالسيوم منخفضان نسبيا ، والحصول على نسبة صورة واحدة كل ثانيتين.

بعد دقيقتين أو ثلاث دقائق ، استبدل الوسط بوسط خال من الكالسيوم. ثم ، لمدة دقيقة أو دقيقتين ، راقب نشاط الكالسيوم الذي يعمل بالمتجر في الخلايا. بعد ذلك ، أضف واحدا من micromolar thapsigargin إلى الخلايا لاستنفاد مخازن الكالسيوم الداخلية.

انتظر من ثماني إلى 10 دقائق ، ثم استبدل الوسط بسرعة بوسط يحتوي على الكالسيوم وسجل لمدة خمس دقائق بينما يدخل الكالسيوم الخلايا عبر قنوات النجاح. بعد إنهاء التجربة ، قم بتحليل الصور. حدد منطقة لا توجد بها خلايا للمنطقة الأولى ، والتي تحدد الخلفية ، ثم حدد منطقة في السيتوبلازم للمنطقة الثانية.

يمكن رسم المنطقتين على أي من الصور في السلسلة. بعد ذلك ، انتقل إلى علامة التبويب "تشغيل التجارب" وحدد الصور المرجعية للقنوات 340 و 380 ، وحدد المنطقة الأولى ، ثم انقر فوق طرح الخلفية. الآن ، قم بتشغيل التجربة بأكملها لإزالة الخلفية من جميع الصور.

بمجرد الانتهاء ، انقر فوق خيار بيانات السجل لفتح جدول بيانات يتم فيه تسجيل بيانات الوقت والنسبة. نمت خلايا العضلات وتوسعت وفرزها باستخدام الفاكس. مثلت الأرومات العضلية أكثر من 60٪ من السكان الذين تم تحليلهم.

ثم تم استزراع الخلايا العضلية البشرية الأولية في وسط التمايز وتلوينها مناعة لعامل النسخ لبروتينات السلسلة الثقيلة MEF2 والميوسين. عبرت غالبية الخلايا عن سلسلة ثقيلة من الميوسين وشكلت أقناتا عضلية بقيم مؤشر اندماج تبلغ حوالي 60٪ ، وظلت 40٪ الأخرى من الخلايا خلايا أحادية النواة غير متمايزة ، والمعروفة أيضا باسم الخلايا الاحتياطية. تم إجراء تجربة دخول الكالسيوم الموصوفة التي تعمل بالمخزن بنجاح على الخلايا المتمايزة.

يظهر إجراء نفس التجربة على الخلايا المنقولة بالحمض النووي الريبي الصغير المتداخل ، الموجه ضد القنوات المنفذة للكالسيوم من عائلة TRPC ، أن الضربة القاضية كان لها تأثير قابل للقياس على دخول الكالسيوم الذي يتم تشغيله في المتجر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الأرومات العضلية البشرية عن عضلات الهيكل العظمي البالغة. نستخدم هذه الخلايا لدراسة الخطوات المتتالية لتمايز العضلات وعلى وجه الخصوص ، تعطيل عوامل النسخ وقنوات الكالسيوم.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أقل من ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. إنها طريقة سريعة وبسيطة وقابلة للتكرار تحصل على محصول الأرومات العضلية البشرية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم منع ثقافات الأرومة العضلية من الوصول إلى الثقة الكاملة ، حيث سيكون هناك تمايز تلقائي غير مرغوب فيه.