نماذج تجريبية لدراسة الحماية العصبية من الوضعية الحمضية ضد نقص التروية الدماغية

الهدف العام من علاج الحماض في نموذج شريحة القشرة المخططة في نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط هو دراسة التأثير العصبي للتكييف الحمضي ضد نقص التروية الدماغي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيف يمكن أن يحمي الحماض بعد التكييف إصابات الدماغ الإقفارية ، وتطوير استراتيجية جديدة لعلاج السكتة الدماغية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على استخدام نماذج التجارب المتاحة على نطاق واسع لدراسة الحماية العصبية للحماض بعد التكييف.

سيوضح الإجراء يارونغ تشنغ ، طالب دراسات عليا من مختبري. ابدأ بإزالة الدماغ من جمجمة فأر مقطوع الرأس بملعقة رفيعة وإسقاطه بعناية في دورق يحتوي على ACSF المثلج البارد المنتظم المتوازن مع خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ أكسجين. ضع الغراء بالتبريد على لوحة الاهتزاز في شريحتين.

ضع قطعة من ثلاثة بالمائة من الاغاروز على شريط الغراء الأبعد عن الشفرة لدعم الدماغ. ثم استخدم الملقط لنقل الدماغ إلى ورق التصفية. قطع العمود الأمامي والمخيخ بشفرة.

ضع أنسجة المخ عموديا على شريط الغراء الحر مع ميل الدماغ على الاغاروز. أضف ACSF المثلج البارد إلى خزان القطع لغمر الدماغ وإضافة الثلج إلى منطقة حامل الثلج. احتفظ ب ACSF في الخزان مليئا بخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ من الأكسجين.

بعد ضبط الاهتزاز لقطع أقسام 400 ميكرون ، ووضع الدماغ بشكل صحيح بالنسبة إلى شفرة القطع ، اضغط على زر البدء والإيقاف لبدء القطع التلقائي. استخدم ماصة باستور ذات طرف مقطوع لنقل خمس شرائح دماغية واحدة تلو الأخرى ووضعها في حامل المناديل في ACSF العادي المثلج المغطى بخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ من الأكسجين. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ضع شرائح الدماغ في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة عشر دقائق لاستعادة وظيفة التشابك العصبي.

ضع ACSF الخالي من الجلوكوز و ACSF الحمضي في حمام مائي 37 درجة مئوية وقم بغلي المحاليل بنسبة خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ نيتروجين و 20٪ ثاني أكسيد الكربون و 80٪ أكسجين على التوالي لمدة 30 دقيقة. انقل بعناية أربع من شرائح الدماغ الخمس إلى ACSF مسخن مسبقا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وخالي من الجلوكوز واحتضنه لمدة 15 دقيقة. لدراسة النافذة الزمنية للتكييف المسبق الحمضي ، انقل شريحة واحدة مباشرة من ACSF الخالي من الجلوكوز إلى ACSF الحمضي وانقل الشرائح الثلاث الأخرى إلى ACSF العادي لإعادة التروية.

بعد ثلاث دقائق ، انقل الشريحة في ACSF الحمضي إلى ACSF العادي. ثم بعد خمس دقائق في ACSF العادي ، انقل إحدى الشرائح من ACSF العادي إلى حامل الأنسجة في ACSF الحمضي لمدة ثلاث دقائق. انقل شريحة أخرى بنفس الطريقة بعد 15 دقيقة من إعادة التروية.

يتم تعيين الشريحة المتبقية التي تم وضعها في ACSF الخالي من الجلوكوز ولكن ليس ACSF الحمضي كمجموعة حرمان من الجلوكوز بالأكسجين. انقل الشرائح من ACSF إلى آبار صفيحة 24 بئرا تحتوي على محلول TTC. مد الشريحة في المحلول.

ثم احتضن عند 37 درجة مئوية في حمام مائي ضحل لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى أنابيب طرد مركزي نظيفة وموزونة سعة 1.5 مليلتر مغطاة بورق الألمنيوم وقم بقياس الوزن الجاف للشرائح. بعد الوزن ، استخرج فورمازان عن طريق إضافة محلول واحد إلى واحد من الإيثانول وثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى الأنابيب بنسبة حجم إلى وزن 10 إلى واحد.

احتضن بعيدا عن الضوء لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، انقل محلول ثنائي ميثيل سلفوكسيد الإيثانول من الأنابيب إلى صفيحة 96 بئر وقم بقياس الامتصاص عند 490 نانومتر باستخدام قارئ لوحة. تأكد أولا من التخدير المناسب من خلال عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم.

ثم ضع الفأر المخدر مع مسبار LDF المتصل بجمجمته في وضع ضعيف وقم بإصلاحه باستخدام خيوط قطنية معقمة. تطهير بشرة الرقبة المحلوقة بالكحول الإيثيلي بنسبة 75٪. ثم بعد إجراء شق جلدي محيط متوسط في الرقبة ، قم بتشريح الأنسجة الرخوة بالملقط لكشف الأوعية الدموية.

أضف قطرة واحدة من المحلول الملحي إلى الأنسجة المكشوفة للحفاظ على رطوبتها. بعد ذلك ، استخدم ملقط العين لتشريح الشريان السباتي المشترك من الأنسجة المحيطة والعصب المبهم. احرص على عدم إتلاف العصب المبهم.

ضع مشبك وعاء صغيرا في الطرف البعيد للشريان السباتي المشترك. واربط عقدة ميتة ب 6-0 خيوط حريرية في الطرف القريب. ثم اربط عقدة فضفاضة قريبة من المشبك كخياطة مؤقتة.

بعد ذلك ، استخدم مقص العيون الدقيق لعمل شق طولي صغير بين العقدتين بالقرب من العقدة الميتة قدر الإمكان. الآن أدخل 12 ملم ، خيوط أحادية ضعيفة من خلال الشق في تجويف الشريان وتقدمها بضعة ملليمترات. شد العقدة السائبة حول طرف الشعيرات الأحادية ثم قم بإزالة المشبك.

ثم استخدم ملقط العين لدفع الفتيل إلى الشريان السباتي الداخلي حتى يظهر برنامج LDF انخفاضا حادا في تدفق الدم. سجل وقت بدء الانسداد. ثم اقطع مسبار LDF ، وضع الفأر في حاضنة 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة من الانسداد.

بعد 55 دقيقة من بدء الانسداد ، قم بتلطيف باستخدام الأيزوفلوران وضع كما كان من قبل. ثم افتح شق الرقبة ، وأعد تعريض الشريان السباتي المشترك. بعد فترة الانسداد ، استخدم ملقط العين لسحب الفتيل برفق لتحقيق إعادة التروية.

ثم قم بتحويل الخيط المؤقت إلى خياطة دائمة عن طريق شد العقدة. لعلاج الحماض ، قم بتغيير الغاز المستنشق بواسطة مخروط الأنف إلى 20٪ ثاني أكسيد الكربون و 20٪ أكسجين و 60٪ نيتروجين لمدة خمس دقائق. بعد إغلاق الشق بخياطة جراحية متقطعة ، ضع الفأر في قفص ساخن بدرجة حرارة 30 درجة مئوية حتى يستعيد الفأر وعيه.

يوضح هذا الرسم البياني نتائج مقايسة TTC التي تم إجراؤها على الشرائح القشرية بعد الحرمان من الجلوكوز بالأكسجين والتكييف الحمضي كما هو موضح في هذا الفيديو. كانت ثلاث دقائق من علاج الحماض واقية من الأعصاب إذا بدأ العلاج مباشرة أو بعد خمس دقائق من الحرمان من الجلوكوز بالأكسجين ، ولكن ليس إذا تم إعادة إنفاذ الشرائح لمدة 15 دقيقة. تعرضت الفئران لمدة 60 دقيقة من انسداد الشريان الدماغي الأوسط وعولجت عن طريق استنشاق 20٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس دقائق في خمس أو 50 أو 100 دقيقة بعد إعادة التروية.

تم تحديد حجم الاحتشاء من خلال تلطيخ اثنين أو ثلاثة أو خمسة ثلاثي فينيلترازوليوم هيدروكلوريد بعد 24 ساعة من إعادة التروية كما هو موضح في الخطوط السوداء المنقطة. يوضح هذا الرسم البياني النسبة المئوية لحجم الاحتشاء لكل حالة. كانت الحماية العصبية من التكييف الحمضي قوية حتى عندما تأخر وقت البداية إلى 50 دقيقة بعد إعادة التروية.

ومع ذلك ، فإن علاج الحماض الذي بدأ في 100 دقيقة لم يمنع الإصابة الإقفارية. بعد مشاهدة الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة الحماية العصبية للحماض بعد التكييف على نموذج OGD لشرائح الدماغ ، وعلى نموذج MSO للفئران. أثناء محاولة الإجراءات ، من المهم أن تتذكر أن تمديد الحماض ومدته مهمان جدا لإعادة إنتاج التأثيرات الوقائية.