والرزن الفسفرة وملزمة Microtubule جنبا إلى جنب مع تعريب بروتين تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة فسفرة تاو ، وقدرات ربط الأنابيب الدقيقة لتاو ، وتوطين تاو ، باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر في خلايا سرطان القولون والمستقيم. يمكن أن تكون هذه الطريقة فعالة في معظم مجالات البحث البيولوجي ، وخاصة أبحاث السرطان والخرف ، حيث تعتبر الفسفرة وربط الأنابيب الدقيقة من العوامل المهمة. الميزة الرئيسية لمقايسة الفوسفوراتاز المقدمة هي أنه يوفر طريقة سهلة لإدراك الفسفرة الكاملة لعينات البروتين.

الميزة الرئيسية هي أن مقايسة ربط الأنابيب الدقيقة هي أنه إجراء بسيط لفصل البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة عن الكسور غير المربوطة. ومع ذلك ، فإن الفوائد الرئيسية لتقنية توطين تاو هي أنها تتطلب كمية صغيرة نسبيا من الأجسام المضادة الأولية والثانوية. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد جميع الكواشف كما هو موضح في بروتوكول النص.

نقل ما يقرب من مليون خلية HCT 116 إلى أطباق مزرعة تحتوي على الحد الأدنى من الوسط الأساسي المكملة ب 10٪ مصل بقري جنين و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. عندما تصل الخلايا إلى 65٪ من التقاء ، استخدم شفاطة لإزالة الوسط المكمل FBS. ثم أضف MEM الخالي من المصل ، والذي يحتوي إما على الكركمين أو كلوريد الليثيوم.

احتضان عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا ب 10 مل من PBS البارد المثلج. أضف ملليلترا واحدا من PBS المثلج ، ثم استخدم مكشطة خلية لكشط الخلايا ونقلها إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر.

جهاز طرد مركزي لمدة أربع دقائق عند 1800 مرة جم وأربع درجات مئوية. نقوم بتعليق كريات الخلية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الكامل RIPA عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة ، مع التأكد من النقر على الأنابيب بانتظام لتحلل الخلايا. بعد ذلك ، قم بصوتنة العينات لفترة وجيزة بسعة 10٪ تنبض لمدة 0.2 ثانية ، وإيقاف تشغيلها لمدة 0.2 ثانية ، ليصبح المجموع 2 ثانية.

جهاز الطرد المركزي تتجانس الخلية عند 22 ، 570 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. انقل المواد الطاففية إلى أنابيب جديدة ذات علامة ثم قم بقياس تركيز البروتين بواسطة مقايسة برادفورد ، كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد تحضير عينات تحتوي على 20 ميكروغراما من البروتين الكلي ، أضف ميكرولترين من محلول الفوسفاتيز القلوي و 10 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوي لكل منهما.

ثم أضف الماء المقطر ، بحيث يكون الحجم النهائي لكل عينة 20 ميكرولترا. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. أثناء احتضان العينات ، قم بإعداد عينات إضافية بنفس التركيز ، ولكن بدون فوسفاتيز للمقارنة.

بعد ساعة واحدة، أوقف التفاعل بإضافة EDTA بتركيز نهائي قدره 50 ملليمولار أو أورثوفانادات الصوديوم بتركيز نهائي يبلغ 10 ملليمولار. أضف المخزن المؤقت لتحميل هلام 4XSDS المحضر حديثا والذي يحتوي على 400 مللي مولار DTT. باستخدام كتلة حرارية ، احتضن العينات عند 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بتدوير العينات ، ثم اتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتحميل 13 ميكرولترا من العينة لكل بئر بالإضافة إلى السلم الجزيئي على هلام بولي أكريلاميد بنسبة 10٪. قم بتوصيل نظام الرحلان الكهربائي بمصدر طاقة ، واضبط الجهد على 70 فولت لمدة 20 دقيقة لنقل عينات البروتين من هلام التكديس إلى هلام الحل.

بعد ذلك ، قم بزيادة إلى 125 فولت وقم بتشغيل الجل لمدة 70 إلى 120 دقيقة تقريبا حتى تصل العينات وسلم البروتين إلى نهاية الجل. باستخدام نظام النشاف الكهربائي الرطب ، انقل الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين عند 100 فولت لمدة 100 دقيقة تقريبا. بعد ذلك ، قم باحتضان الغشاء لتلطخ في 4٪ من ألبومين مصل الأبقار لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

احتضان اللطخة طوال الليل في محلول الجسم المضاد الأولي عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل اللطخة ثلاث مرات في PBST ، واغسلها لمدة سبع دقائق في كل مرة. احتضن في محلول الأجسام المضادة الثانوية غير المؤكدة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم اغسلها باستخدام PBST أربع مرات مع كل غسلة تستمر سبع دقائق. قم بتطوير اللطخة باستخدام مجموعة تلألؤ كيميائي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتغطية اللطخة المطورة بغلاف بلاستيكي شفاف ، ثم احصل على صور تلألؤ كيميائي للبقعة باستخدام نظام تصوير التلألؤ الكيميائي المتاح تجاريا.

بعد تحضير عينات جديدة ، احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. جهاز الطرد المركزي الفائق للعينات عند 100 ، 000 مرة G و 25 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد ذلك ، انقل 120 ميكرولترا من كل مادة طافية تحتوي على تاو غير مرتبط إلى أنابيب منفصلة وتنظيفة ومصنفة.

أضف 120 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة Fibic إلى الحبيبات التي تحتوي على تاو المقيد. بعد الخلط جيدا ، عن طريق الدوامة والماصة ، انقل الخليط إلى أنابيب نظيفة ذات علامات عليها. بعد تحضير عينات من تركيز البروتين المكافئ ، أضف عازلة تحميل هلام 4XSDS جديدة تحتوي على 400 مللي مولار DTT.

استخدم كتلة حرارية لاحتضان العينات عند 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. قم بتدوير العينات ثم اتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. قم بتحميل 13 ميكرولترا من العينة لكل بئر وسلم الوزن الجزيئي على هلام بولي أكريلاميد بنسبة 10٪.

قم بتوصيل الأقطاب الموجبة والسالبة لنظام الرحلان الكهربائي بمصدر طاقة ثم اضبط الجهد على 70 فولت لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، قم بزيادة إلى 125 فولت وقم بتشغيل الجل لمدة 70 إلى 120 دقيقة تقريبا حتى تصل العينات وسلم البروتين إلى نهاية الجل. استخدم نظام النشاف الكهربائي الرطب لنقل الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين عند 100 فولت لمدة 100 دقيقة تقريبا.

احتضان الغشاء لتلطخة في 4٪ ألبومين مصل البقر لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضن طوال الليل في محلول الأجسام المضادة الأولية عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل اللطخة أربع مرات باستخدام PBST مع كل غسلة تستمر سبع دقائق.

احتضان اللطخة المغسولة في محلول الأجسام المضادة الثانوية ذات الصلة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسلها باستخدام PBST لمدة سبع دقائق مع تكرار الغسيل أربع مرات. تطوير البقعة باستخدام مجموعة تلألؤ كيميائي.

قم بتغطيتها بغلاف بلاستيكي شفاف ، واحصل على الصور باستخدام نظام تصوير التلألؤ الكيميائي. للبدء ، ضع زلات الغطاء في آبار لوحة غطاء الأنسجة المكونة من ستة آبار ، ثم قم بزرع 250،000 خلية في كل بئر في وسط الثقافة الموصى به. بعد 24 ساعة ، اشطف الخلايا مرتين باستخدام PBS.

أضف MEM الخالي من المصل ، والذي يحتوي على الكركمين واحتضانه عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا باستخدام PBS المثلج مرة أخرى. ثبت الخلايا في 3.7٪ فورمالديهايد في حاضنة 37 درجة مئوية ، في الظلام.

اغسل الخلايا باستخدام PBS ، ثم قم بتثبيت الخلايا في الميثانول المثلج عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، احتضان الخلايا على الجليد في 3٪ BSA و 0.1٪ Triconex 100 في PBS لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا باستخدام PBS ثم احتضن في المخزن المؤقت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف 60 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة الأولية إلى قطعة فلوريد البولي فينيلدين المقطوعة في كل بئر. وضع زلات الغطاء بحيث تتلامس الخلايا مع محلول الجسم المضاد. احتضن طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة مظلمة ورطبة.

في اليوم التالي ، اغسل الخلايا أربع مرات باستخدام PBS. أضف 80 ميكرولترا من محلول الجسم المضاد الثانوي إلى كل قطعة من قطع فلوريد البولي فينيلدين ، مع وضع زلات الغطاء بحيث تتلامس الخلايا مع محلول الجسم المضاد. احتضن في غرفة رطبة مظلمة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا أربع مرات باستخدام PBS. قم بتركيب العينات في وسط التركيب باستخدام DAPI ، ثم قم بتثبيت زلات الغطاء على الشرائح الزجاجية. ثم احتضن في غرفة مظلمة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة ونصف.

باستخدام مجهر متحد البؤر ، افحص الشرائح. في هذه الدراسة ، يتم تقييم فسفرة تاو المحددة باستخدام جسم مضاد فوسفو تاو. ينظر إلى الخلايا المعالجة بالكركمين للتعبير عن انخفاض تاو مع زيادة تركيز الكركمين.

ناحية أخرى ، ينظر إلى زيادة تعبير فوسفو تاو عند تركيزات أقل من الكركمين ، ويتناقص فقط عند التركيزات العالية جدا. ثم يتم فحص الخلايا المعالجة بكلوريد الليثيوم. كما يتضح ، ينخفض التعبير عن كل من تاو وفوسفو تاو بشكل كبير في ظل معالجة كلوريد الليثيوم.

ثم يتم تقييم الفسفرة الإجمالية عن طريق فحص الفوسفوتاز. ينظر إلى تاو على أنها تهاجر بشكل أسرع في العينات المعالجة بالفوسفوتاز مقارنة بعينة التحكم غير المعالجة ، مما يشير إلى أن عينة التحكم مفسفرة. أظهرت عينات الخلايا المعالجة بالكركمين نتائج متشابهة جدا ، مما يشير إلى أن خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم العلاجية لم تقلل من فسفرة تاو.

قامت كل من العينات المعالجة بالفوسفاتيز وغير المعالجة بالكهرباء بنفس النطاق تقريبا في عينات الخلايا المعالجة بكلوريد الليثيوم مما يشير إلى انخفاض في فسفرة تاو. بعد ذلك ، تم إنشاء مقايسة الربط الأنبوبي الدقيقة لعينات الخلايا بنجاح باستخدام tau 352 كعنصر تحكم إيجابي. كما هو موضح هنا ، يؤدي كل من الكركمين والتركيز المنخفض للعلاج بكلوريد الليثيوم إلى تثبيط نشاط ربط الأنابيب الدقيقة.

ثم يتم إجراء الفحص المجهري متحد البؤر. بعد علاج الكركمين ، ينظر إلى تاو على أنه ينتقل إلى النواة. هذا يدعم الدراسات السابقة ، التي تشير إلى أن تاو النووي هو اللاعب الرئيسي في حماية الحمض النووي العصبي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فحص الفوسفاتيز لتحديد الفسفرة الكاملة لعينات البروتين وكيفية إجراء مقايسة ربط الأنابيب الدقيقة. يجب أن تكون قادرا على معرفة كيفية تنفيذ مقايسة التألق المناعي عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام كمية أصغر مختلفة من الأجسام المضادة. الإجراءات المعروضة هنا فعالة من حيث التكلفة ومن المحتمل أن تساعد في اكتشاف وتطوير عوامل علاجية جديدة لعلاج أنواع التاوفوريز والسرطانات المختلفة.