تسجيل اللدونة متشابك في شرائح هيبوكامبال الحاد تحتفظ في صغيرة الحجم-إعادة التدوير، ونضح-، وغمر من نوع نظام الدائرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير طريقة لضمان وسائل مبسطة لكربوجين ACSF لإعادة التدوير بكميات صغيرة وتحقيق تسجيلات طويلة الأجل للإمكانات الميدانية باستخدام غرفة تسجيل مثبتة على مجهر فلوري. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المرونة العصبية المتعلقة بمسارات اللجنين الأساسية التي تنظم الانتقال المشبكي وتشكيل الذاكرة في وضع خلوي للتعلم والذكريات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تساعد على استقرار مستوى الأكسجين في خزان حيوي صغير لتعزيز كفاءة تكلفة التجارب باستخدام مضادات أو ناهضات محددة.

يتم توضيح تحضير شرائح الحصين الحادة من قبل طلاب الدكتوراه ، Xia و Weiguang من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء ، استخدم شفرة جراحية باردة لتشريح قطعة من القشرة الظهرية بزاوية 70 درجة على طول الحافة الظهرية لكل نصف كرة أرضية. باستخدام ملعقة أسمنتية باردة للأسنان ، انقل كل نصف كرة إلى قطعة من ورق الترشيح لتجفيف السطح لفترة وجيزة.

قم بتركيب نصفي الكرة الأرضية بأسطح مقطوعة حديثا على منصة التقطيع المثلجة الباردة باستخدام غراء لاصق سريع المفعول بحيث يواجه الطرف الذيلي لنصفي الكرة الأرضية شفرة الحلاقة. بعد ذلك ، ضع منصة التقطيع في غرفة التبريد الخاصة بالاهتزاز. املأ الغرفة بمخزن التقطيع عند درجتين إلى أربع درجات مئوية وكربوجينيها.

بعد ذلك ، قم بقص شرائح 350 ميكرومتر باستخدام إعدادات اهتزاز مناسبة. اعزل تكوين الحصين من القشرة السفلية والقشرة الداخلية باستخدام قنيتين للحقن كمقص. قم بإزالة الفقاعات من شبكة تثبيت الشرائح لغرفة الحضانة المعدة مسبقا باستخدام ماصة باستور.

بعد ذلك ، انقل الشرائح التي تتمتع ببعض الشفافية في الطبقة الهرمية من منصة التقطيع على شبكة غرفة الحضانة باستخدام ماصة باستور كبيرة الفم. في هذه الخطوة ، أضف موصل أنبوب ثلاثي الاتجاهات إلى تدفق نظام إعادة التدوير. قم بتوصيل الذراع الأوسط لموصل الأنبوب ثلاثي الاتجاهات بأنبوب إمداد الكربوجين وتنظيم معدل التدفق باستخدام مقياس تدفق الهواء.

بعد ذلك ، أضف موصل أنبوب ثان ثلاثي الاتجاهات إلى تدفق نظام إعادة التدوير. قم بتوصيل الذراع الأوسط بالأنبوب المواجه للسخان المضمن ، والجزء العلوي من الذراع بأنبوب سيليكون رفيع ، والذراع السفلي بأنبوب التدفق من الخزان. بعد ذلك ، ضع عصارة أنبوبية على أنبوب سيليكون رفيع في موضع على طول الأنبوب حيث يكون نبض ACSF في حجرة الشريحة الناتجة عن المضخة الانبساطي في الحد الأدنى.

الآن ، انقع قطعة صغيرة من ورق تنظيف العدسة وشبكة نايلون مثبتة على سلك بلاتيني على شكل حرف U في غرفة شرائح الغمر لبضع دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة السلك البلاتيني على شكل حرف U. قم بإيقاف تشغيل إعادة التدوير وضع شريحة على ورق تنظيف العدسة.

ثم ضع على الفور شبكة تثبيت الشريحة فوق الشريحة. قم بتشغيل المضخة واترك الشريحة تتوازن لمدة 30 دقيقة دون غمس الهدف في ACSF. في غضون ذلك، املأ قطب التسجيل ب ACSF وقم بتثبيته في حامل الماصة.

تحقق من عزل قطب التحفيز المعدني عن طريق وضعه في محلول بيكربونات الصوديوم. قم بتوصيل القطب الكهربائي بالقطب السالب لمولد جهد التيار المستمر ولاحظ تكوين الفقاعات عند الطرف تحت مجهر التشريح. بعد ذلك ، ضع قطب تحفيز التنغستن المعزول بالأبوكسي المختبر في حامل المناور والسلك المرجعي في غرفة الشريحة.

أضف قطبا مرجعيا ثانيا إلى الغرفة وقم بتوصيله بالمقبس المرجعي لمرحلة الرأس لقطب التسجيل. في برنامج التحكم في مكبر الصوت ، انقر فوق مربع وضع المشبك الصفري ، ثم انقر نقرا مزدوجا فوق مربع قائمة كسب الإخراج. اختر ربحا قدره 100 ، وانقر نقرا مزدوجا فوق وعاء صندوق مرشح التمرير العالي ، واختر ثلاثة كيلو هرتز ، وانقر نقرا مزدوجا فوق مربع قائمة مرشحات التمرير المنخفض AC لاختيار 0.1 هرتز.

في برنامج التسجيل ، انقر فوق الحصول ، افتح البروتوكول. اختر بروتوكولا يحتوي على الإعدادات التي تسمح بالتحفزات العرضية ورقمنة الإمكانات المضخمة من 10 إلى 20 كيلو هرتز لمدة 50 إلى 100 مللي ثانية ويؤدي تلقائيا إلى تشغيل عازل محفز بعد 10 مللي ثانية من بدء التسجيل العرضي. ضع أقطاب التحفيز والتسجيل في خط وبالتوازي مع الطبقة الهرمية.

بعد ذلك ، انقر فوق الحصول على البروتوكول وتحرير البروتوكول واختر علامة التبويب المشغل في النافذة المنبثقة. انقر فوق مربع مصدر المشغل واختر شريط المسافة كمصدر المشغل. ثم انقر فوق الزر "موافق" وانقر فوق زر التسجيل لبدء عملية الاستحواذ.

في برنامج عزل التحفيز ، انقر فوق مربع التحكم في الجهد وأدخل صفر. انقر فوق زر التنزيل. بعد ذلك ، انقر فوق نافذة برنامج التسجيل واضغط على مفتاح المسافة.

كرر هذه الدورة عن طريق إدخال قيم متسلسلة من 1000 إلى 8000. ربط قوة التحفيز بقيم منحدر FEPSP وتحديد قوة التحفيز المطلوبة للحصول على 40٪ من الحد الأقصى لمنحدر FEPSP. انقر فوق مربع التحكم في الجهد وأدخل القيمة المحددة.

ثم انقر فوق زر التنزيل. في برنامج التسجيل ، انقر فوق الزر "إيقاف" ثم قائمة الاكتساب. انقر فوق تعديل البروتوكول واختر علامة تبويب المشغل في النافذة المنبثقة.

بعد ذلك ، انقر فوق مربع مصدر المشغل واختر المؤقت الداخلي كمصدر للمشغل. انقر فوق الزر "موافق" ، متبوعا بزر التسجيل الذي يبدأ التسجيل التلقائي لإمكانات المجال كل 60 ثانية. انقر فوق زر الإيقاف بعد 30 إلى 60 دقيقة.

في برنامج التسجيل ، انقر فوق الحصول ، وافتح البروتوكول ، واختر نفس البروتوكول مثل التسجيل الأساسي. انقر فوق الزر موافق ثم انقر فوق تسجيل. استمر في تشغيل التسجيلات المحتملة في الحقل تلقائيا لمدة ساعتين إلى أربع ساعات.

عند الانتهاء ، انقر فوق الزر "إيقاف" لإنهاء التسجيل. يوضح هذا الشكل التسجيلات التمثيلية للتقوية المعتمدة على النشاط للانتقال المشبكي باستخدام كربوجين التدفق الخارج وكربوجين الخزان مع إعادة تدوير خزان ACSF صغير. تم تحفيز التقوية بعد النقطة الزمنية صفر بمقدار ثلاثة أضعاف 100 هرتز في القطارات في الثانية.

يوضح هذا الشكل أن كربوجين التدفق الخارج مع إعادة تدوير خزان ACSF صغير أدى إلى تحسين الحث LTD مقارنة بالتجارب مع كربوجين الخزان فقط. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تحضير الشريحة في غضون خمس إلى 10 دقائق ويمكن أيضا تحقيق تسجيل محتمل ميداني مستقر لعدة ساعات إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم ضبط مستوى الكربوجين ، وسرعة التروية ، وموضع الأقطاب الكهربائية ، وإجهاد التحفيز لمكافئتك المحددة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طريقة أخرى مثل مشبك التصحيح ، والفحص المجهري للطب الشرعي من أجل الإجابة على الأسئلة الإضافية مثل ترجيل توطين العصارة الخلوية لمجسات الغراب استجابة لتحريض اللدونة المشبكية المعتمدة على النشاط. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المرونة العصبية لاستكشاف اللدونة المشبكية المعتمدة على النشاط كطريقة خلوية للتعلم والذاكرة في شرائح الحصين في المختبر من علامات التبويب الجيدة وجينات الفأر المعدلة وراثيا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحضير شريحة حادة من الحصين الصدغي وكيفية الحصول على ظروف مستقرة للتسجيل طويل الأمد للإرسال المشبكي باستخدام حجم صغير من ACSF المعاد تدويره.

لا تنس أن العمل مع والمركبات الكيميائية يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والتطهير المناسب أثناء تنفيذ هذا الإجراء.