تحسين تطبيق أمين ديكستران بيوتينيلاتيد عالية الوزن الجزيئي للإسقاط ثالاموكورتيكال تتبع في الفئران

الهدف العام من هذا الفيديو هو إظهار بروتوكول مكرر لتطبيق BDA عالي الوزن الجزيئي لدراسة الملصقات العصبية المثلى في الجهاز العصبي المركزي. يمكن أن يساعد هذا الإجراء في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الشبكات العصبية. من خلال تصور بنية إطار الملصقات العصبية من خلال الدوائر العصبية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر الفرصة لبدء دوائر عصبية محلية وخصائصها الكيميائية. قم بإعداد حقنة ميكرولتر واحدة ، مزودة بميكروبيبت زجاجي ، واختبرها عن طريق سحب البارافين السائل. بعد تخدير الجرذ باستخدام بروتوكول معتمد ، تأكد من التخدير العميق من خلال عدم وجود رد فعل على قرصة الذيل.

ثم احلق الجزء العلوي من رأس بشفرة حلاقة كهربائية وافرك موقع الجراحة باستخدام 10٪ بوفيدون اليود ، متبوعا بنسبة 70٪ إيثانول. قم بتأمين الجرذ في الجهاز التجسيمي عن طريق إدخال قضبان أذن غير حادة في الأذنين ووضع القواطع العلوية للفأر في حامل الفم. ضع مرهم للعيون على العينين.

استخدم قفازات وستائر جراحية معقمة للحفاظ على الظروف المعقمة. نظف جلد الرأس في موقع الجراحة مرة أخرى باستخدام 70٪ من الإيثانول. بعد عمل شق سهمي في الجلد بمشرط ، على طول الخيط السهمي ، استخدم أدوات تطبيق معقمة ذات رؤوس قطنية لكشط العضلات والسمحاق بعيدا عن الجمجمة.

باستخدام إحداثيات محددة مسبقا من أطلس ، حدد موقع حج القحف. قم بإجراء حج القحف باستخدام مثقاب لدغ مع رأس دائري للحفر إلى عمق ملليمتر واحد تقريبا حتى تظهر السحايا. استئصال الأم الجافية باستخدام ملقط دقيق لفضح القشرة الدماغية فوق موقع الحقن.

طرد البارافين السائل من المحقنة الدقيقة ثم ارسم محلول BDA بنسبة 10٪. قم بتركيب المحقنة في جهاز الحقن المجهري وقم بتوصيل المضخة الدقيقة. تحت المجهر المجسم ، قم بمعالجة جهاز الحقن المجهري.

أدخل الماصة الدقيقة الزجاجية المملوءة في VPM من خلال السطح القشري للدماغ ، على عمق 5.8 ملم. بعد ذلك ، استخدم المضخة الدقيقة لحقن 100 نانولتر من 10٪ BDA بالضغط في VPM ، على مدى ثلاث دقائق. بعد خمس دقائق ، اسحب الماصة ببطء.

خياطة الجرح بخيط معقم ، ثم ضع الجرذ في منطقة تعافي دافئة ، حتى يستعيد وعيه ويتعافى تماما. بعد القتل الرحيم للفأر ، استخدم المقص والملقط لفتح التجويف الصدري للفأر والوصول إلى القلب. أدخل قسطرة وريدية في البطين الأيسر، باتجاه الشريان الأورطي، ثم افتح الأذن الأيمن.

أولا ، قم بتناول محلول ملحي بنسبة 0.9٪ في درجة حرارة فسيولوجية ، لمدة دقيقة إلى دقيقتين تقريبا ، حتى يصبح الدم الخارج من القلب صافيا. ثم استمر في تناول 250 إلى 300 مل من 4٪ بارافورمالدهايد ، في محلول فوسفات 0.1 مولار. بعد إصلاح الدماغ المقطوع في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

ثم انقل الدماغ إلى 30٪ سكروز في 0.1 مولار PBS والحماية بالتبريد لمدة ثلاثة أيام عند أربع درجات مئوية. بعد ثلاثة أيام ، عندما يغرق الدماغ في المحلول ، قسم الدماغ إلى ثلاث كتل في الاتجاه الإكليلي بمساعدة مصفوفة دماغية. تحتوي الكتلة المركزية على النواة البطنية الخلفية الإنسية للمهاد في القشرة الحسية الجسدية الأولية.

قم بتركيب الكتلة المركزية للدماغ في مرحلة التجميد من الميكروتوم المنزلق للتقسيم في المستوى الإكليلي والقسم عند 40 ميكرون عند التجميد. اجمع الأقسام في طبق مكون من ستة آبار ، يحتوي على 0.1 مولار PBS. ابدأ في التلوين عن طريق شطف الأقسام في 0.1 مولار PBS لمدة دقيقة واحدة تقريبا مع الهزاز.

ثم انقل الأقسام إلى محلول مختلط من الستربتافيدين-AF594 في صبغة الفلورسنت الخضراء AF500 / 525 في 0.1 مولار PBS تحتوي على 0.3٪ Triton X-100 ، واحتضانها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد التلوين ، اغسل الأقسام ثلاث مرات في 0.1 molar PB مع الهزاز. قم بتركيب الأقسام على شرائح المجهر باستخدام التقنيات الكيميائية النسيجية القياسية.

جفف الأقسام في الهواء لمدة ساعة تقريبا. ضع 50٪ من الجلسرين في الماء المقطر على الأقسام الصدرية وقم بتغطية الانزلاق قبل تصوير الشرائح. يظهر هذا الرسم المجهري التمثيلي موقع حقن BDA باللون الأحمر للنواة البطنية الخلفية الإنسية للمهاد على خلفية تلطيخ نيسل الأخضر.

يتم عرض ملصقات BDA الصدرية هنا ، بما في ذلك محاور المهامال كورتيكول في الطبقة الرابعة والخلايا العصبية المهادية القشرية في الطبقتين الخامسة والسادسة. للمقارنة ، يوضح هذا الرسم المجهري أن وضع العلامات التقليدية على BDA باستخدام إجراء بيروكسيداز أفيدين بيوتين القياسي يكشف عن نمط مماثل من الملصقات العصبية لوضع العلامات الجسدية على BDA. يظهر عرض التكبير العالي هذا للقسم المصير المسمى BDA العرش المحورية المسماة مسبقا بالتفصيل باللون الأحمر.

عرض جسم الخلية العصبية المسمى برجعي والتشعبات والعمود الفقري بالتغصني بالتفصيل هنا. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء بضع القحف والحقن التجسيمي في غضون 20 إلى 30 دقيقة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق BDA عالي الوزن الجزيئي لإحياء الروابط العصبية والبنية التفصيلية للوسم العصبي.