ا

الهدف العام من هذا الفحص لتجنب النحاس على أساس الحالة الغذائية هو تقييم النيماتودا المستجيبة لمواد كيميائية طاردة ومصدر غذاء على مدار أربع ساعات. هذا يسمح بالتقييم المتزامن للحالة الغذائية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد مجال علم الأعصاب السلوكي من خلال تحديد المتحولات التي لا تستطيع تعديل الأنماط الحركية والاستجابة لمادة كيميائية طاردة على الرغم من ظروف الجوع.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراؤها على مدى فترة زمنية طويلة، مما يسمح بتحليل الحالة الغذائية حيث تصبح الديدان أكثر جوعًا بشكل تدريجي على مدار أربع ساعات. لتحضير الكائنات التجريبية للفحص، اختر 10 ديدان في مرحلة L4 لكل تيار، قبل 24 ساعة من بدء الفحص، للتأكد من أن الكائنات هي بالغين صغار عند اختبارهم. لكل متحول أو دودة تحكم تم اختبارها، اختر 10 L4s.

احتفظ بالكائنات L4، باستخدام الطرق القياسية لمدة 24 ساعة على ألواح أجار قياسية مزروعة بـ OP50 E.Coli. قبل 24 ساعة من الفحص، استخدم مسطرة وعلامة دائمة سميكة لرسم خط على الجانب السفلي من وسيط نمو النيماتودا المحضر مسبقًا أو لوحة NGM على طول الحافة الخارجية. قم بوضع علامة على حاجز منتصف الخط على مسافة متساوية من كل حافة من لوحات.

زرع اللوحة بـ 50 ميكرولتر من OP50 E.Coli على جانب واحد فقط من حاجز النحاس لإنشاء طبقة متساوية. استخدم الخطوط المحددة على الجانب السفلي من اللوحة لضمان عدم ملامسة البكتيريا لمحلول النحاس. تأكد من أن محلول النحاس سيحدد حافة اللوحة ويشكل حاجز منتصف الخط ونقل البكتيريا بحيث لن يلام محلول النحاس بمصدر الغذاء.

ضع علامة على مجموعة ثانية من اللوحات بدون OP50 E.Coli، لتكون بمثابة التحكم السلبي. اترك البكتيريا تجف، ثم قم بحضانة اللوحات عند 37 درجة مئوية طوال الليل. تأكد من عدم إزعاج بقع البكتيريا عند نقل الديدان إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية.

قد يؤدي الاضطراب المفرط إلى تغيير موقع أو شكل بقعة الغذاء. بعد الحضانة الليلية، قم بإزالة اللوحات من الحاضنة واستخدم الجانب السفلي المحدد من اللوحة كدليل، قم بعزل 100 ميكرولتر من محلول كبريتات النحاس (II) 0.5 مولار معد حديثًا على حافة الأجار، لإنشاء حاجز نحاس خارجي. قم بعزل 25 ميكرولتر من محلول كبريتات النحاس (II) لإنشاء حاجز منتصف الخط.

تأكد من أن محلول كبريتات النحاس (II) لا يلاممس بقعة البكتيريا واترك محلول النحاس ليجف على اللوحة. تحقق من الجفاف كل خمس دقائق بعد النقل، باستخدام منديل مختبري بمسح الخفيف للمحلول بالقرب من حافة اللوحة للتمييز. قبل الفحص مباشرة، قم بنقل الكائنات التجريبية إلى لوحة أجار خالية من البكتيريا واترك الديدان تتحرك بحرية لمدة دقيقة واحدة لإزالة البكتيريا الزائدة.

بعد ذلك، قم بعزل ملليلتر واحد من M9 على اللوحة مع البالغين الصغار، التي تم نقلها قبل 24 ساعة لنقل الديدان إلى أنبوب طرد مركزي صغير. قم بفصل الديدان عند 3000 × G لمدة دقيقة واحدة. يجب أن تشكل الديدان كريات في قاع الأنبوب.

استخرج محلول M9 دون تعطيل كريات الديدان. أضف ملليلتر واحد من محلول M9 إلى كريات الديدان. قم بقلب الأنبوب لخلط الديدان بالمحلول.

إذا تم نقل بكتيريا زائدة في البداية مع الديدان، كرر الأمر لمدة خمس مرات إجمالاً. بعد الغسل النهائي، قم بعزل المحلول الفائق حتى يتبقى 100 ميكرولتر من محلول M9 وكريات الديدان. قم فورًا بنقل الديدان من المحلول بعد اكتمال عمليات الاستخلاص.

قم بعزل 20 ميكرولتر من كريات الديدان من أسفل الأنبوب على النصف الخالي من البكتيريا من لوحة الفحص، تأكد من نقل 10 ديدان إلى لوحة الفحص وأنه لا يوجد طعام ملوث. لا ينبغي نقل البكتيريا إلى لوحات سباق الغذاء النحاسي. قم بإزالة محلول M9 الزائد من الديدان باستخدام منديل مختبري خلال دقيقة واحدة.

تأكد من أن محلول M9 لا يلاممس محلول كبريتات النحاس (II) وأن الديدان وسطح الأجار لا يزالان سليمين. قم بالتخلص من الديدان التي تم إزالتها عن طريق الخطأ باستخدام منديل المختبر. بمجرد إزالة محلول M9، وبدء جميع الديدان في أنماط حركية غير سائلة، أي عندما يتوقفون عن الرجوع.

ابدأ توقيت الفحص، إذا تم تضمين ديدان إضافية عن طريق الخطأ، قم بإزالتها عن طريق الاختيار باستخدام زيت الهالوجينات للتأكد من عدم إضافة أي بكتيريا إلى اللوحة. تحقق من لوحات الفحص كل 30 دقيقة. بالنسبة للوحات الفحص التي تحتوي على بقع بكتيريا، قم بتسجيل الكائنات بشكل إيجابي إذا وصلت إلى بقعة الغذاء على مدار أربع ساعات.

بالنسبة للوحات التحكم السلبية، قم بتسجيل الكائنات بشكل إيجابي إذا عبرت الحاجز. استخدمنا متحول N2 وفقدان وظيفة npr-9 ومتحول npr-9 للإفراط في التعبير، المشار إليه باسم npr-9 لكسب وظيفة، لتقييم الاستجابات للجوع وتجنب النحاس. في نهاية الفحص، أعاد 100٪ من الكائنات من النوع البري الانتقال إلى مصدر الغذاء، بينما لم تعدل كائنات npr-9 للإفراط في التعبير الأنماط الحركية استجابةً للغذاء واستمرت في عبور الحاجز الطارد حتى بعد ملامسة مصدر الغذاء.

على لوحة خالية من الغذاء، نادرًا ما عبرت كائنات n2 أو npr9 لفقدان الوظيفة حاجز النحاس بينما عبرت الديدان npr-9 للإفراط في التعبير الحاجز بشكل متكرر إلى الأمام والخلف. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم تذكر تجنب تعطيل حاجز النحاس عند نقل الديدان و M9 وكذلك الحفاظ على ظروف ثابتة لكل سلالة لتجنب العوامل المربكة.