أسلوب لوصف امبريوجينيسيس في نبات

الهدف العام من هذه الطريقة هو توصيف تكوين نمط الأجنة أثناء التطور الجنيني للنبات باستخدام الكائن الحي النموذجي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المادة النباتية ، مثل التطور الجنيني في نبات الأرابيدوبسيس. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن تكوين نمط الجنين في نبات نبات الأرابيدوبسيس النموذجي يمكن أن يتميز بالعملية الموصى بها.

يوضح الإجراء Jinlin Feng ، طالب دراسات عليا من مختبري. لبدء هذا الإجراء ، أضف 100 بذرة إلى أنبوب سعة 1.5 مل. أضف ملليلتر واحد من هيبوكلوريت الصوديوم لتعقيم البذور.

اقلب الأنبوب عدة مرات للتأكد من خلط البذور والمحلول جيدا. بعد خمس دقائق ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 1200 Gs لمدة 30 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية واغسل البذور بالماء المعقم أربع مرات لإزالة أي هيبوكلوريت صوديوم متبقي.

بعد ذلك ، أضف 4.4 جرام من خليط الملح القاعدي MS و 10 جرامات من السكروز إلى لتر واحد من الماء شديد النقاء. يقلب حتى يذوب الملح والسكروز. باستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم عند مول واحد ، اضبط درجة الحموضة في المحلول على 5.8.

ثم أضف ثلاثة جرامات من عامل التبلور وقم بتعقيم المحلول عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. صب 30 مل من وسط MS الناتج في طبق استزراع 12 سم. ضع البذور المعقمة على طبق MS.

انقل الطبق إلى الثلاجة ، واحتفظ به أربع درجات مئوية في الظلام لمدة ثلاثة أيام لتقسيم البذور إلى طبقات. بعد ذلك ، احتفظ باللوحة في غرفة النمو في ظل ظروف نهار طويل لمدة ثمانية أيام. ثم انقل النباتات إلى التربة في صينية.

قم بتغطية الصينية بغطاء أبيض شفاف لمنع فقدان الماء. ترك فجوة صغيرة لتجنب تزجيج النباتات. بعد خمسة أيام ، قم بإزالة الغطاء وزرع النباتات في غرفة المشي في ظروف النهار الطويل.

بعد حوالي 20 يوما من النمو ، استخدم خيطا لتمييز 10 إلى 15 براعم زهرة في موضع سيقان البذور والإزهار في الساعة 8:00 مساء. حدد بداية تلقيح البويضة عندما تفتح البراعم المميزة لتزهر في الساعة 8:00 صباحا في صباح اليوم التالي. لبدء تحضير محلول هوير ، أضف 24 جراما من الكلورهيدرات إلى أنبوب سعة 50 مل. لف الأنبوب بالكامل بورق الألمنيوم ، وتأكد من أن الرقاقة تغلق كل الضوء.

أضف تسعة ملليلتر من الماء فائق النقاء وثلاثة ملليلتر من الجلسرين. رج الأنبوب لإذابة الكلورهيدرات. بعد ذلك ، اترك محلول Hoyer المحضر يقف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة للتخلص من أي فقاعات.

للبدء ، قم بإرفاق قطعة من الشريط اللاصق على الوجهين بشريحة زجاجية مجهرية. ضع السيليك المزروع لعدد الأيام المطلوب بعد التلقيح على الجانب مع الحاجز الكاذب بشكل عمودي على السطح. باستخدام إبرة حقنة ، قم بتقسيم الرسغ على جانبي الحاجز الكاذب.

بعد ذلك ، قم بإرفاق الرسغين التشريح بالشريحة بحيث تكون البويضات والسيليك مرئية تحت مجسم قم بتوزيع 70 ميكرولترا من محلول Hoyer على الشريحة الزجاجية. ثم اغمس زوجا من الملقط ذو الرؤوس الدقيقة في المحلول لترطيب الحافة.

باستخدام المنظار المجسم والملاقط ، انقل البويضات إلى محلول هوير لتنظيف الأجنة. بعد ذلك ، ضع زلة غطاء برفق على الشريحة ، مع التأكد من عدم توليد أي فقاعات. ضع الشريحة النهائية في صندوق في غرفة مظلمة لمدة ساعتين إلى 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

بعد مرور الوقت اللازم ، استخدم وظيفة DIC بالمجهر لفحص البويضات التي تم تطهيرها. حدد موقع الأجنة تحت مجال منخفض الطاقة ، ثم قم بالتغيير إلى مجال عالي الطاقة لمراقبة النمط الخلوي في الأجنة المتطورة. ثم افحص الأجنة في مراحل النمو المختلفة.

للبدء ، قم بإعداد بلازميد DR5 GFP وإدخاله في النباتات البرية بواسطة البكتيريا الزراعية إلى التحول بوساطة الميثاسيان كما هو موضح في بروتوكول النص. حدد نباتات T1 باستخدام ألواح MS المتوسطة التي تحتوي على hydrolysin. بعد ذلك ، قم بنقل النباتات وزراعتها كما هو موضح في بروتوكول النص للحصول على نباتات T3.

باستخدام خيط ، ضع علامة على براعم الزهور لنبات T3 متماثل اللواقح في موضع سيقان البذور عند الإزهار في الساعة 8:00 مساء. بعد ذلك ، امزج ثلاثة ملليلتر من الجلسرين مع 47 مل من الماء النقي للغاية لتوليد محلول جلسرين بنسبة 6٪. ثم قم بإرفاق قطعة من الشريط اللاصق على الوجهين بشريحة زجاجية مجهرية. ضع سيليك نبات T3 على الشريحة مع الحاجز الكاذب بشكل عمودي على السطح.

باستخدام إبرة حقنة ، قم بتقسيم الرسغ على جانبي الحاجز الكاذب. قم بإرفاق الرسغين المقطعين بالشريحة بحيث تكون البويضات والسيليك مرئيتين تحت مجسم بعد ذلك ، قم بتوزيع 30 ميكرولترا من 6٪ من الجلسرين على الشريحة.

اغمس زوجا من الملقط ذو الرؤوس الدقيقة في المحلول لترطيب الطرف. باستخدام المنظار المجسم والملاقط ، انقل البويضات إلى محلول الجلسرين. ضع زلة غطاء برفق على الشريحة.

ثم اضغط على الشريحة بسرعة ولطف لإخراج الجنين من البويضة. بعد ذلك ، استخدم الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر لفحص الشريحة بحثا عن مضان البروتين الفلوري الأخضر. ابحث عن الأجنة المعزولة تحت حقل منخفض الطاقة ، وسجل موقعها.

قم بالتغيير إلى مجال عالي الطاقة واضبط مصدر ضوء الإثارة على 488 نانومتر لمراقبة تعبير GR5 GFP في الأجنة. بعد ذلك ، اكتشف تعبير GFP ، وقم بتمييز تكوين نمط الجنين كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذه الدراسة ، لوحظ التطور الجنيني في نبات الأرابيدوبسيس عن طريق تصفية البويضة ، كما يتضح

بعد إزالة البويضات ، يمكن تمييز الأجنة في مراحل النمو المختلفة باستخدام الفحص المجهري لتباين التداخل التفاضلي. ثم يتم تسجيل نمط التعبير عن GR5 GFP أثناء التطور الجنيني تحت الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر. ينظر إلى DR5 على أنه يتم التعبير عنه في القطب الجذري للأجنة الكروية وشكل القلب من النوع البري.

يظهر DR5 معبرا عنه في أطراف النبتة الجنينية ، وفي الأوعية الدموية للأجنة البرية الناضجة. بعد ذلك ، فإن دور naa10 في نبات الأرابيدوبسيس أثناء التطور الجنيني هو فحصه. لوحظ أن الفرضية مقسمة بشكل غير طبيعي ، مع الانقسام المنحرف والرأسي في naa10 مقارنة بالتقسيم غير المتماثل العرضي في النباتات البرية.

في الحمار الذي يظهر هنا ، فإن الثيران لها توزيع موحد تقريبا في معظم أجنة naa10 في المرحلة الكروية ، وتحتفظ بإشارة أوسع في الفرضيات مقارنة بالأجنة البرية. تشير هذه النتائج إلى أن naa10 مطلوب للتطور الجنيني ، وأنه يمكن استدعاؤه عبر مسار إشارات الثيران في نبات الأرابيدوبسيس. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر كيفية زراعة نبات الأرابيدوبسيس كمادة نباتية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تدابير أخرى مثل التهجين في الموقع من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التعبير عن الجينات الخاصة بالخلايا. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التطور الجنيني لاستكشاف الآلية الجزيئية التي تتوسط بها جينات معينة التطور الجنيني في نبات الأرابيدوبسيس. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيف التطور الجنيني في نبات الأرابيدوبسيس.