تحديد التعبير عن سطح الخلية ومعدل إندوسيتيك من البروتينات في الثقافات أستروسيت الابتدائية باستخدام بيوتينيلاتيون

في هذا الفيديو ، سيتم تقديم طريقتين ، البيوتينيل على سطح الخلية ، والبيوتينيل بمطاردة النبض. في العرض التوضيحي التالي ، سنستخدم الخلايا النجمية. هذه هي أكثر أنواع الخلايا الدبقية وفرة في الدماغ ، وتصادف أنها تعبر عن البروتين الذي يثير اهتمامنا وهو Aquaporin-4.

يمكن تطبيق الطرق التي نستخدمها في هذه الورقة على العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، ويمكن أن تشمل تلك الخلايا إما الخلايا المعلقة أو الخلايا الملتصقة. يمكن استخدام هذه التقنيات لدراسة التعبير عن سطح الخلية واستيعاب أي بروتين عبر الغشاء تقريبا ، طالما أنه يمتلك مجالا خارج الخلية يمكن الوصول إليه بواسطة البيوتين. الهدف العام من اختبار البيوتينيل الحيوي لسطح الخلية هو تحديد تأثيرات اللامينين على التعبير عن القناة المنفذة للماء Aquaporin-4 في غشاء البلازما للخلايا النجمية.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإزالة مزارع الخلايا النجمية من الحاضنة ، وتخلص من الوسيط عن طريق الشفط. اغسل الخلايا ثلاث مرات بأربعة ملليلتر من CM-PBS المبرد ، وضع الأطباق على الثلج المجروش. قم بإزالة CM-PBS عن طريق الشفط ، ثم قم بإدخال ملليلترين من محلول البيوتين في كل بئر.

قم بإمالة الأطباق برفق ذهابا وإيابا عدة مرات لضمان التغطية الكاملة قبل وضع المزارع على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت للبيوتين ، واستبدله بأربعة ملليلتر من مخزن التبريد واحتفظ بالثقافات على الجليد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بالشفيق واستبداله بنفس الكمية من مخزن التبريد قبل ترك المزارع على الجليد لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، تخلص من مخزن التبريد واغسل الخلايا ثلاث مرات بأربعة ملليلتر من CM-PBS المبرد. بعد ذلك ، اكشط الخلايا إلى مليلتر واحد من CM-PBS المبرد وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. بعد ذلك ، قم بتحبيير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 100 جم لمدة ثلاث دقائق في جهاز طرد مركزي دقيق مبرد مضبوطة على أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من محلول التحلل. ثم اترك العينات على الجليد لمدة 30 دقيقة ، مع الدوامة كل خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحللات عند 14 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لحبيبات أي منظف ومواد قابلة للذوبان.

ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. وفر 50 ميكرولترا من المحللة ، وأضف 25 ميكرولترا من ثلاثة عازلة تحميل X إليها. بعد ذلك ، قم بتغيير طبيعته عن طريق التسخين عند 95 درجة مئوية في حمام جاف.

هذا هو جزء الإدخال ، الذي يحتوي على كل من بروتينات سطح الخلية الحيوية بالإضافة إلى البروتينات العصارية الخلوية غير الحيوية. باستخدام طرف ماصة مقطوع ، انقل 75 ميكرولترا من حبات الستربتافيدين الاغاروز إلى المحللة ، واحتضانها عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات على شاكر. بعد ذلك ، قم بتكسير حبات الستربتافيدين الاغاروز عن طريق الطرد المركزي عند 1 ، 500 جم لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية.

وفر 50 ميكرولترا من المادة الطافية وأضف 25 ميكرولترا من ثلاثة عازلة تحميل X. ثم قم بتغيير طبيعته عند 95 درجة مئوية في حمام مائي أو كتلة تدفئة. يمثل هذا الجزء داخل الخلايا ، ويتكون بشكل أساسي من بروتينات العصارة الخلوية غير الحيوية.

بعد ذلك ، قم بتعليق الخرزات المحببة في مليلتر واحد من محلول الغسيل وهزها لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية. حبيبات الخرز وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه العملية أربع مرات أخرى لتقليل الارتباط غير المحدد للبروتينات العصارية الخلوية غير الحيوية.

أضف 50 ميكرولترا من مخزن التحميل المخفف إلى X واحد باستخدام المخزن المؤقت للتحلل. إطلاق البيوتين والستربتافيدين من الخرزات عن طريق تغيير طبيعتها عند 95 درجة مئوية. يجب أن يحتوي هذا الجزء على بروتينات سطح الخلية الحيوية فقط.

بعد ذلك ، افصل المدخلات وسطح الخلية والكسور داخل الخلايا بواسطة SDS-PAGE وقم بتحليلها عن طريق النشاف الغربي. الهدف العام لتجربة البيوتينيل بمطاردة النبض هو تحديد معدل الاستيعاب التقريبي ل Aquaporin-4 في الخلايا النجمية. أولا ، قم بإزالة مزارع الخلايا النجمية من الحاضنة وشفط الوسط.

ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات بأربعة ملليلتر من CM-PBS المبرد وضع الأطباق على الثلج المجروش. قم بشفط CM-PBS ، ثم قم بإدخال ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للبيوتين في كل طبق. قم بإمالة الأطباق ذهابا وإيابا عدة مرات للتأكد من توزيع المخزن المؤقت جيدا واتركه على الجليد لمدة 30 دقيقة.

ثم استنشق المخزن المؤقت للبيوتين ، واستبدله بخمسة ملليلتر من الوسط الدافئ. احتضن طبق استزراع واحد على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وطبقا ثانيا بنفس درجة الحرارة لمدة 30 دقيقة. اترك طبقا آخر عند أربع درجات مئوية كعينة دقيقة صفر.

في نهاية فترة الحضانة ، تخلص من الوسط واغسل الخلايا ثلاث مرات بأربعة ملليلتر من CM-PBS المبرد. بعد ذلك ، قم بشفط CM-PBS ، ثم ماصة ستة ملليلتر من المخزن المؤقت المختزل فوق الخلايا ، واترك العينة على الجليد لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، استبدل الوسط بستة ملليلتر من المخزن المؤقت الطازج ، وضع العينة على الجليد لمدة 15 دقيقة إضافية.

هذه الخطوة حاسمة لأن الجلوتاثيون الموجود داخل المخزن المؤقت المختزل سوف يشق واحة البيوتين المتبقية على سطح الخلية. هذا يضمن أن البروتينات الداخلية فقط سيتم تسميتها بالبيوتين. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الاختزال ، واستبدله بستة ملليلتر من مخزن التبريد.

اترك العينة على الثلج لمدة 15 دقيقة أخرى ، وكرر خطوة التبريد مرة أخرى. بعد ذلك ، تخلص من مخزن التبريد ، واغسل الخلايا ثلاث مرات ، بأربعة ملليلتر من PBS المبرد. قم بشفط CM-PBS ، ثم كشط الخلايا إلى مليلتر واحد من PBS المبرد ، باستخدام رافع الخلايا ، ونقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.

حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 100 غرام لمدة ثلاث دقائق. بعد ثلاث دقائق ، تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من محلول التحلل. اترك العينة على الجليد لمدة 30 دقيقة ، ودوامة كل خمس دقائق.

الطرد المركزي المحللة عند 14 ، 000 جم ، لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، لحبيبات المنظفات والمواد القابلة للذوبان. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. وفر 50 ميكرولترا من هذا المحلل ، وأضف عازلة التحميل.

بعد ذلك ، قم بتغيير طبيعة الخلايا عند 95 درجة مئوية ، في حمام جاف. هذا هو جزء الإدخال ، الذي يحتوي على كل من البروتينات الداخلية الحيوية ، بالإضافة إلى البروتينات غير الحيوية. باستخدام طرف ماصة مقطوع ، أضف 150 ميكرولترا من ملاط الستربتافيدين الاغاروز إلى المحللة ، واحتضنه عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات ، على شاكر.

بعد ثلاث ساعات ، قم بحبيبات الستربتافيدين الاغاروز عن طريق الطرد المركزي ، عند 1 ، 500 جم لمدة 30 ثانية ، عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق الخرزات في ملليلتر واحد من محلول الغسيل ، وهزها لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية. حبيبات الخرز وتخلص من المادة الطافية.

كرر هذه العملية أربع مرات أخرى لتقليل الارتباط غير المحدد للبروتينات العصارية الخلوية غير الحيوية. بعد ذلك ، قم بتكسير الخرزات عن طريق الطرد المركزي عند 1 ، 500 جم لمدة 30 ثانية ، عند أربع درجات مئوية. تخلص من المخزن المؤقت للغسيل المغطى ، وأضف 50 ميكرولترا من مخزن تخزين واحد ×.

إطلاق البيوتين والستربتافيدين من الخرز, عن طريق تغيير طبيعة عند 95 درجة مئوية. يجب أن يحتوي هذا الجزء على بروتينات سطح الخلية الداخلية فقط. بعد ذلك ، افصل المدخلات وسطح الخلية والكسور غير المنضمة ، بواسطة SDS-PAGE ، وقم بتحليلها عن طريق النشاف الغربي.

يظهر هنا سطح الخلية ، داخل الخلايا ، والكسور الكلية من الخلايا النجمية غير المعالجة ، والخلايا النجمية المعالجة ب 24 نانومولار لامينين ، تم فحصها بحثا عن أكوابورين -4 ، وبيتا ديستروجليكان. يوضح هذا الرسم البياني الاختلافات في مستويات سطح الخلية من Aquaporin-4 ، في الخلايا النجمية غير المعالجة والمعالجة باللامينين ، والتي تم تطبيعها ضد بيتا ديتروجليكان. في هذا الشكل ، تم فحص كسور البروتين الداخلية التي تم جمعها عند صفر و 15 و 30 دقيقة بحثا عن Aquaporin-4.

ويلخص هذا الرسم البياني استيعاب Aquaporin-4، لأربع تجارب مستقلة، تم تطبيعها مقابل قيم النقطة الزمنية للدقيقة الصفرية. تشير العلامة النجمية إلى زيادة ذات دلالة إحصائية في كمية Aquaporin-4 ، التي يتم تحصيلها بين 15 و 30 دقيقة. عندما يتم استخدام الجلوتاثيون لكسر رابطة ثاني كبريتيد في نظير البيوتين القابل للانقسام ، فإن مساهمة سطح الخلية أكوابورين -4 في الجزء الحيوي ، تقل بشكل حاد.

مما أدى إلى فرق واضح بين عينات دقيقة الصفر و 15 دقيقة. عندما يتم حذف الخطوة ، فإن الإشارة الناشئة من تجمع سطح الخلية ، تجعل التغيير بين النقطتين الزمنيتين غير قابل للاكتشاف. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل التألق المناعي والفحص المجهري TIRF للإجابة على أسئلة إضافية ، بما في ذلك الاتجار المادي للبضائع.