نانوبوري تسلسل الحمض النووي لتحليل التربة الجينومية

الهدف العام من هذا الفيديو هو توضيح كيفية تسلسل الحمض النووي للتربة الميتاجينومي باستخدام منهجية تسلسل المسام النانوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة المعلمين على إدخال تسلسل الحمض النووي في بيئة الفصل الدراسي وتوفير توليد في الوقت الفعلي لبيانات تسلسل الحمض النووي الجديدة لتحليلها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة وبأسعار معقولة وتتطلب الحد الأدنى من معدات المختبرات.

تمنح هذه التقنية الطلاب أيضا الفرصة لاستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية الأكثر تعقيدا والتي تتوفر عادة في فصول المختبرات. يعمل هذا البروتوكول القصير مع مجموعة تسلسل سريع. للبدء ، أضف 200 نانوجرام من الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي إلى أنبوب رقيق الجدران سعة 0.2 مليلتر وقم بتعبئة الحجم بالماء المقطر إلى 7.5 ميكرولتر.

بعد ذلك ، أضف 2.5 ميكرولتر من مزيج التجزئة من المجموعة واخلط الأنبوب برفق باستخدام الانقلابات. ثم استخدم نبضة الطرد المركزي لتدوير محتويات الأنابيب. الآن انقل الأنبوب إلى جهاز تدوير حراري لمدة دقيقة واحدة عند 30 درجة مئوية ، تليها دورة ثانية مدتها دقيقة واحدة عند 75 درجة مئوية.

ثم قم بتدوير الأنبوب مرة أخرى. لإكمال المكتبة المعدلة والمربوطة ، أضف ميكرولتر واحد من المحول السريع و 0.2 ميكرولتر من مزيج حاد / TA ligase الرئيسي. ثم استخدم الانعكاس لخلط الأنبوب ، متبوعا بدوران نبض آخر وتخزين الأنبوب على الجليد.

أولا ، قم بإعداد جهاز التسلسل ، وقم بإزالة خلية التدفق من عبوته وإرفاقه بجهاز التسلسل المحمول في الوقت الفعلي. ثم قم بتوصيل جهاز التسلسل بجهاز كمبيوتر باستخدام كابل USB وابدأ تشغيل برنامج التسلسل. في البرنامج ، حدد الأمر start device واختر خيار النظام الأساسي لمراقبة الجودة.

ثم اضغط على تنفيذ لتشغيل مراقبة الجودة. بعد حوالي سبع دقائق ، سيكتمل تشغيل مراقبة الجودة. يشير التمييز الأخضر في القراءة إلى وجود مسام نشطة متاحة لتسلسل الحمض النووي.

مطلوب ما لا يقل عن 800 مسام نشطة. انتقل الآن إلى مربع الحوار. في حقل معرف العينة، أدخل اسم العينة المراد تسلسلها.

بالنسبة لمعرف خلية التدفق، أدخل الرمز الموجود على الملصق المرفق بالجزء العلوي من خلية التدفق. افتح الآن غطاء جهاز التسلسل ثم حرك غطاء منفذ التحضير إلى اليسار للوصول إلى المنفذ. الآن قم بإزالة بضعة ميكرولترات من المخزن المؤقت ، بما في ذلك فقاعة صغيرة موجودة غالبا.

الآن قم بعمل مخزن مؤقت كاف لملء مجموعة المستشعر. قم بإعداد مليلتر واحد من المخزن المؤقت الطازج المختلط جيدا. ثم أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحضير وانتظر خمس دقائق.

بعد خمس دقائق ، أضف 200 ميكرولتر المتبقية من المخزن المؤقت للفتيلة. لإعداد المكتبة لتحميل البرد RBF1 و LLB على الجليد جنبا إلى جنب مع المكتبة المكيفة والمربوطة. ثم أضف إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد 0.2 مليلتر 25.5 ميكرولتر من RBF1 و 12 ميكرولترا من الماء الخالي من النواة بدرجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بخلط LLB مع ماصة التخلي ثم خذ 26.5 ميكرولتر وأضفه إلى الأنبوب باستخدام RBF1 المخفف. امزج الكواشف باستخدام المزيد من التريتوري لمنع الخرز بداخلها من الاستقرار. أضف الآن 11 ميكرولترا من المكتبة المعدلة والمربوطة واخلط الأنبوب برفق باستخدام الانعكاس.

ثم استخدم دوران النبض لتجميع العينة. أثناء تجنب الخرزات ، خذ 75 ميكرولترا من العينة وأضفها إلى المكان عند إسقاط المنفذ من حيث الحكمة. تأكد من أن كل قطرة تتدفق إلى المنفذ قبل إضافة المنفذ التالي.

عند تحميل العينة ، من الضروري أن تدخل كل قطرة إلى المنفذ قبل إضافة القطرة التالية. من المهم أيضا تجنب إعادة تعليق الخرزات عند تحميل منفذ العينة الذي يمكن أن يسد المنفذ. الآن استبدل غطاء منفذ العينة مع التأكد من دخول السداد إلى المنفذ.

ثم استبدل غطاء الجهاز واستمر في تنفيذ خيار تشغيل التسلسل لمدة 48 ساعة المحدد من خلال البرنامج. يوفر استخدام الإجراء الموصوف طريقة سريعة وغير مكلفة لتسلسل الحمض النووي للتربة للأغراض التعليمية. عادة ما ينتج عن عمليات التشغيل أكثر من 125,000 قراءة بمتوسط أكثر من 5,000 زوج أساسي.

تم إعطاء كل جولة درجة جودة لاختيار تلك الأكثر فائدة لمزيد من التحليل. بعد ذلك ، أخضع كل طالب 50 تسلسلا من 350 نيوكليوتيد على الأقل لتحليل BLASTN أو BLASTX لتحديد الكائن الحي من العينة. يعتبر الكائن الحي المحدد بقيم إلكترونية أقل من 0.0004 تطابقات قوية.

العديد من التسلسلات المعرضة ل BLASTN حيث لا مثيل لها ومصنوعة تتعلق بكائنات جديدة. كشفت BLASTX عن العديد من البروتينات من الكائنات الحية غير الممثلة في تحليل BLASTN. من الأهمية Endopeptidase و ATPase مثل البروتينات حيث تم تحديدها.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير وتحليل الحمض النووي للتربة للتسلسل باستخدام تقنية تسلسل المسام النانوية. يمكن إكمال هذا البروتوكول في ساعتين ونصف ، ويتطلب الحد الأدنى من معدات المختبر أو الخبرة الفنية ويمكن إكماله في بيئة الفصول الدراسية. أثناء محاولة هذا الإجراء وإكماله ، من المهم أن تتذكر توصيل الكواشف بعناية ، وخلط العينات جيدا وأجهزة الطرد المركزي بين الخطوات لتجنب فقدان العينة.