ميكروتيسويس 3D للعلاج عن طريق الحقن بالتجدد وفحص المخدرات الفائق

الهدف العام من تصنيع الهلاميات الدقيقة ثلاثية الأبعاد المرنة التي يسهل اختراقها باستخدام التجيل بالتبريد هو تسهيل العلاج التجديدي عن طريق الحقن وفحص الأدوية عالية الإنتاجية في المختبر. يعرض هذا الفيديو بروتوكولات تصنيع الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد متعددة الاستخدامات وتطبيقها على العلاج التجديدي وفحص الأدوية. تعمل تقنية العلاج التجديدي على تحسين الاحتفاظ بالخلايا الجذعية وبقائها على قيد الحياة والوظائف العلاجية بعد الحقن في موقع الجرح.

كما تم تحسين فحص المخدرات بسبب سهولة الاستخدام وإمكانية الفحص عالي الإنتاجية. بشكل عام ، يكافح الأفراد الجدد في ثقافة 3D بسبب البروتوكولات المعقدة. تعمل هذه التقنية على تبسيط الثقافة ثلاثية الأبعاد وتوفر للباحثين تحكما أكبر في الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد الناتجة.

سيساعد في عرض هذه الإجراءات Zhou Lyu و Liu Wei و Li Yaquian و You Zhifeng ، أربعة طلاب دراسات عليا من مختبرنا. اغسل رقائق مصفوفة الاستنسل الدقيقة PMMA بالماء منزوع الأيونات لإزالة الحطام المتبقي من النقش بالليزر. ثم جفف رقائق مصفوفة الاستنسل الدقيقة عند 60 درجة مئوية.

بعد ذلك ، عالج الرقائق المجففة في منظف البلازما في مجموعات من أربعة. أولا ، قم بتشغيل مضخة التفريغ لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، استخدم 18 واط من طاقة التردد اللاسلكي لمدة ثلاث دقائق لزيادة ماء الرقائق.

الآن ، اصنع ملليلترا واحدا من محلول سلائف الجيلاتين لكل خمس رقائق. قم بإذابة الجيلاتين في حمام مائي بدرجة حرارة 60 درجة مئوية واحتضان المحلول على الثلج لمدة خمس دقائق. بمجرد أن يبرد قليلا ولكن لا يزال سائلا ، امزج الجلوتارالديهايد جيدا في محلول سلائف الجيلاتين إلى تركيز نهائي قدره 0.3٪ جلوتارالديهايد.

الآن ، قم بوضع 200 ميكرولتر من المحلول المحضر على السطح العلوي لكل شريحة. وزعي المحلول بالتساوي على الرقائق باستخدام قضيب زجاجي مثني. بعد ذلك ، انقل رقائق المصفوفة المحملة بالمحلول على الفور إلى فريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 16 ساعة للتبريد.

في اليوم التالي ، قم بتبريد المجفف بالتجميد إلى 40 درجة مئوية تحت الصفر على مدار 30 دقيقة تقريبا. بعد ذلك ، قم بتحميل رقائق المصفوفة ، وقم بتجميدها لمدة ساعتين تحت فراغ. سوف يتسامى الجليد في ظل هذه الظروف ، وستكون الرقائق جاهزة للاستخدام.

ابدأ بحصاد المجهرات الدقيقة الفردية من الرقائق. ابدأ بتراكب شريحة مصفوفة microcryogel المصنعة أعلى مجموعة دبوس القاذف PDMS المصنعة. قم بمحاذاة كل ميكرو كريوجيل مع دبوس قاذف.

ثم اضغط على شريحة مصفوفة microcryogel في المصفوفة لإزاحة microcryogels من آبارها. الآن ، قم بحصاد الهلاميات الدقيقة المقذوفة في حمام مائي ، واجمعها بمساعدة مصفاة خلوية. استخدم مصفاة واحدة لجمع كل المواد الهلامية الدقيقة من شريحة واحدة.

بعد ذلك ، اغسل المجهرات الدقيقة ببوروهيدريد الصوديوم على الثلج. اسمح بإخماد بقايا الألدهيد غير المتشابكة لمدة 20 دقيقة تقريبا. بعد ذلك ، تخلص من بوروهيدريد الصوديوم ، واغسل الهلاميات الدقيقة بخمسة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات لمدة 15 دقيقة.

قم بإجراء ما مجموعه ثلاث إلى خمس غسلات بالماء قبل المتابعة. بعد إزالة المجهرات الدقيقة من آخر غسول بالماء ، استخدم الملقط لنقلها من مصفاة الخلية إلى طبق بتري مقاس 35 ملم. تشكل كل مجموعة من المجهرات المجهرية مجموعة واحدة.

الآن ، أضف 50 إلى 70 ميكرولترا من الماء منزوع الأيونات إلى كل مجموعة من microcryogels ، وقم بتغطية الطبق. بعد ذلك ، اضغط برفق على الطبق لتسوية أي هلام دقيق مكدس. بعد ذلك ، قم بتجميد المواد الهلامية الدقيقة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة أربع إلى 16 ساعة.

في وقت لاحق ، قم بتجميدها لمدة ساعتين كما كان من قبل. الخطوة التالية هي صنع الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد. أولا ، قم بتعقيم microcryogels.

بعد ذلك ، قم بحصاد الخلايا باستخدام التربسين ، وتحديد كثافتها ، وإعادة تعليقها عند ثمانية ملايين خلية لكل مليلتر في وسط النمو. بعد ذلك ، قم بوضع 60 ميكرولترا من تعليق الخلايا على كل مجموعة من الهلاميات الدقيقة. احتفظ بالأطباق في غرفة رطبة ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين حتى تمتص الخلايا في المواد الهلامية.

بعد الحضانة ، أضف ملليلترين من وسط الثقافة إلى كل طبق ، واستمر في الثقافة ، وقم بتغيير الوسيط كل يومين. في غضون يومين ، ستتشكل الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد. لحقن الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد في الفأر ، قم أولا بنقلها إلى ماصة سعة خمسة ملليلتر ، ثم قم بتحميلها في مصفاة خلية لتصفية وسط الاستزراع.

ثم ، قم بإعادة تعليق الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد في محلول جيلاتين بنسبة 15٪. بعد تحضير للزرع ، قم بحقن الأنسجة الدقيقة في العضل في ثلاثة مواقع من عضلة الجراسيليس. يجب أن تحتوي كل حقنة على 150 ميكرو هلام في 150 ميكرولتر من المحلول.

استخدم حقنة سعة ملليلتر واحد بإبرة قياس 23. بعد تجميع مجموعة microcryogel لزراعة الخلايا على الرقاقة ، ضعها بعناية في غرفة رطوبة مسخنة مسبقا دون أن تبللها. ثم قم بنقل ثلاثة ميكرولترات من تعليق الخلايا المختلطة جيدا بعناية مباشرة على كل بئر ميكرو كريوجل.

اسمح لطرف الماصة بلمس سطح الميكروبريدهيل برفق قبل طرد المحلول. لا تزرع الآبار الطرفية. بعد تحميل الآبار ، أضف 10 ميكرولتر من الوسط الانتقائي إلى كل بئر ، وأضف وسيطا إلى الآبار الطرفية لإبطاء التبخر باستخدام موزع سائل 96 قناة.

بعد ذلك ، قم بزراعة الرقائق في غرفة الرطوبة لمدة 24 ساعة لتشكيل أنسجة دقيقة ثلاثية الأبعاد. في اليوم التالي ، باستخدام موزع السوائل المكون من 96 قناة ، أضف 10 ميكرولترات من الأدوية إلى كل بئر في تدرج تركيز أربع مرات لإكمال إضافة جميع الآبار البالغ عددها 384 ، بما في ذلك أدوات التحكم DMSO. ثم استمر في الثقافة لمدة 24 ساعة.

بعد 24 ساعة من العلاج بالعقاقير ، أضف أربعة ميكرولترات من محلول مخزون الريزازورين إلى كل بئر ، واحتضن اللوحة لمدة ساعتين ، مما يسمح للخلايا باستقلاب الريزازورين. لفحص استقلاب الخلايا للريزازورين ، استخدم قارئ لوحة. كان للهلام الدقيق الجيلاتين المحصود أشكالا وأحجاما محددة مسبقا.

أظهر التحليل الذي أجرته SEM أن المجهرات المجهرية تحتوي على هياكل كبيرة مسامية مترابطة بأحجام مسام تتراوح بين 30 و 80 ميكرون. تم تقييم قابلية حقن الجيلاتين المجهري من الناحية الكمية عن طريق زراعتها بعد الحقن. تم حقن 1 ، 000 لكل مليلتر بستة نيوتن أقل من القوة المقبولة سريريا البالغة 10 نيوتن.

احتفظت الخلايا الجذعية في المجهرات المجهرية بقابلية عالية للبقاء وقدرة تكاثرية كبيرة بعد الحقن خلال خمسة أيام من الاستزراع. باستخدام هذه الخلايا ، تم علاج نموذج نقص تروية أطراف الفأر علاجيا ، وتم فحص الحالة الفسيولوجية للأطراف الإقفارية بعد 28 يوما من الجراحة. أدى علاج الأنسجة الدقيقة ب 100،000 خلية جذعية إلى تحسين إنقاذ الأطراف.

25٪ فقط من الفئران بتر إصبع القدم تلقائيا بعد 28 يوما. في تطبيق مختلف ، تم استخدام مجموعة الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد لاختبار الأدوية عالية الإنتاجية. عولجت خلايا سرطان الخلايا الكبدية بالدوكسوروبيسين ، وعولجت خلايا سرطان الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة باستخدام IMMLG-8439.

في كلتا الحالتين ، زادت مقاومة الأدوية عن طريق الزراعة ثلاثية الأبعاد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع هلاميات دقيقة ثلاثية الأبعاد مرنة ثلاثية الأبعاد لثقافة ثلاثية الأبعاد خارج الرقاقة باستخدام العلاج التجديدي عن طريق الحقن أو مصفوفات ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد على الرقاقة لفحص المخدرات عالية الإنتاجية. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلاج التجديدي القائم على الخلايا وفحص الأدوية ، للاستفادة من زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد ، وبالتالي تطوير كلا المجالين البحثيين.

لا تنس أن العمل مع الجلوتارالديهايد وبوروهيدريد الصوديوم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء الملابس الواقية المناسبة والعمل تحت غطاء المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.