تصوير يعيش خلية من الخلايا الفطرية للتحقيق في أوضاع الدخول والتعريب سوبسيلولار من ديفينسينس النباتية المضادة للفطور

ديفينسينس النباتية دوراً هاما في الدفاع عن النبات ضد العوامل الممرضة. للاستخدام الفعال لهذه الببتيدات المضادة للفطور كوكلاء المضادة للفطور، فهم أساليب العمل (MOA) أمر بالغ الأهمية. هنا، يتم وصف أسلوب تصوير خلية يعيش لدراسة الجوانب الحرجة لوزارة الزراعة من هذه الببتيدات.

الهدف العام من طريقة تصوير الخلايا الحية هذه هو دراسة الجوانب الحاسمة لآليات عمل ديفينسينات النبات المضادة للفطريات في الخلايا الفطرية. مع ظهور تقنيات الفحص المجهري متحد البؤر المتقدمة ، أصبح تصوير الخلايا الحية أداة قوية لدراسة طرق عمل الدفاعات النباتية المضادة للفطريات. باستخدام هذه التقنية ، نقدم هنا طريقة للمساعدة في الإجابة على السؤال الرئيسي في فهم طرق عمل المدافعات النباتية المضادة للفطريات.

ينصب تركيزنا على كيفية استيعاب هذه الببتيدات في الخلايا الفطرية وكيف يتم توطين هذه الببتيدات في عضيات الخلية أو نشرها في السيتوبلازم. لعمل تعليق كونيدي لسلالة PH-1 من Fusarium graminearum ، قم أولا بإعداد ثقافات السلالة على الألواح التي تحتوي على وسط كامل. زرعتها عند 28 درجة مئوية على مدار خمسة أيام.

لإنتاج الكونيديا ، قم بتلقيح أربعة سدادات قطرها 10 ملم من المزرعة البالغة من العمر خمسة أيام في 50 مل من وسط كربوكسي ميثيل السليلوز. قم بزراعة هذه المقابس لمدة أربعة إلى سبعة أيام عند 28 درجة مئوية على شاكر دوار مضبوطة على 180 دورة في الدقيقة. عندما يكون للثقافات لون أحمر ، تشكلت الكونيديا.

لجمع الكونيديا في معلق ، قم بتدوير الثقافة السائلة ، وقم بتصفية مليلتر واحد منها من خلال طبقتين من مادة الترشيح ، في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر. الطرد المركزي التعليق لمدة دقيقتين ، وتخلص من المادة الطافية. ثم اغسل الحبيبات بملليلتر واحد من الماء المعقم ، وكرر الطرد المركزي.

بعد ذلك, أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من 2x SFM. بعد ذلك ، قم بحساب الكونيديا باستخدام مقياس الدم ، واضبط كثافة التعليق على 100 ، 000 كونيديا لكل مليلتر. لعمل معلق كونيدي Neurospora crassa ، انقل الكونيديا من مزارع المخزون إلى أنبوب مائل يحتوي على وسط أجار فوغل ، واحتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة تحت ضوء مستمر لمدة خمسة أيام.

بعد خمسة أيام ، انقل كمية صغيرة من الثقافة المتنامية ، باستخدام حلقة التلقيح ، إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على ملليلترين من وسط فوغل السائل. تأكد من خلط الكونيديا من الحلقة. بعد ذلك ، قم بتصفية التعليق ، وقم بطرده ، وأعد تعليق حبيبات الكونيديا في وسط Vogel دون خطوة غسيل.

أخيرا ، اضبط التعليق النهائي على 100 ، 000 كونيديا لكل مليلتر. لتحضير النبتات للفحص المجهري متحد البؤر ، ضع ماصة 50 ميكرولترا من تعليق الكونيديا على طبق استزراع 35 ملم ، واترك الكونيديا تنبت لمدة ثلاث إلى ست ساعات في درجة حرارة الغرفة. للفحص المجهري متحد البؤر ، قم بوضع ماصة 50 ميكرولترا من المعلق المخروطي في بئر صغير بحجم 10 ملم من طبق ذو قاع زجاجي.

بعد ذلك ، عند الحد الأدنى من التركيز المثبط المحدد مسبقا ، أضف 50 ميكرولترا من الديفينسينات المصنفة بالفلورسنت إلى التعليق ، واحتضن الكونيديا مع المدافعين المسمى لمدة 2.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، أضف ميكرولترين من الصبغة الانتقائية الغشائية FM4-64 ، للحصول على تركيز نهائي يبلغ خمسة ميكرومولار. ثم احتضن المزرعة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل فحص الكونيديا.

لإعداد المجهر متحد البؤر ، حدد ليزر الضوء الأبيض. استخدم الليزر 488 نانومتر و 550 نانومتر لإثارة الدينسينات المسمى بالرودامين وصبغة FM4-64 ، على التوالي. اضبط هذه الليزر على شدة 1٪ ثم اضبط الأطوال الموجية للكشف على 580 إلى 700 نانومتر للديفينسين المسمى بالرودامين ومن 690 إلى 800 نانومتر لصبغة FM4-64.

الآن ، اجمع الصور. للتصوير بفاصل زمني ، أضف 50 ميكرولترا من التعليق المخروطي في طبق ميكروويل ذو قاع زجاجي. بعد ذلك ، قم بتركيب طبق microwell على المجهر ، وابحث عن الخلايا تحت طاقة منخفضة.

ثم قم بالتبديل إلى هدف نفط 100x و 1.44. لمراقبة الدفاعات المسماة DyLight550 ، اضبط خط الليزر على 550 نانومتر للإثارة ومن 560 إلى 600 نانومتر للكشف. بعد ذلك ، اضبط وضع المسح الضوئي على xyzt.

بعد ذلك ، قم بتعيين موضع Z ، والتكبير / التصغير ، وتكرار التقاط الصورة ، وما إلى ذلك ، حسب الحاجة. الآن ، إلى المعلق المخروطي ، أضف 50 ميكرولترا من الدفاعات المسمى بالفلوروفور عند الحد الأدنى من التركيز المثبط لثلاثة ميكرومولار ، وأضف ميكرولترين من الصبغة الانتقائية الغشائية FM4-64 للحصول على تركيز نهائي من خمسة ميكرومولار. ثم أعد تركيز البصريات إذا لزم الأمر.

قبل التقاط الصور ، ضع قطعا صغيرة من ورق الترشيح المبلل في طبق الميكروويل لمنع التبخر. بعد ذلك ، قم بالتقاط صورة كل 3.5 دقيقة على مدار 2.5 ساعة. تم إجراء تصوير الخلايا الحية لتتبع ومقارنة الاستيعاب والتوطين تحت الخلوي لاثنين من الدفاعات من Medicago truncatula.

تم الاتجار ب defensin four المركب كيميائيا المسمى بالرودامين بشكل مختلف في Neurospora crassa و Fusarium graminearum. قام FM4-64 بتسمية أغشية البلازما لكلا الفطريين. ومع ذلك ، في الفيوزاريوم ، ينتشر ديفينسين أربعة في السيتوبلازم.

بينما في Neurospora ، يتم نقله إلى أجسام حويصلية. للمقارنة ، تم تصور ديفينسين خمسة باستخدام ملصق DyLight550 في Neurospora crassa ، جنبا إلى جنب مع وضع العلامات على غشاء البلازما بواسطة FM4-64. يظهر التصوير بفاصل زمني أن هذا الديفينسين يدخل الخلايا في غضون 30 إلى 40 دقيقة ثم ينتشر عبر السيتوبلازم.

وهذا يختلف عن الاتجار ب ديفينسين أربعة الذي يدخل الخلايا ويبقى محاصرا داخل الأجسام الحويصلية حتى بعد ثلاث ساعات. باختصار ، يعد تصوير الخلايا الحية أداة قوية لزيادة فهمنا لطرق عمل الاختلافات النباتية المضادة للفطريات. مع الأصباغ الفلورية الحيوية الأخرى والعلامات الخلوية ، لديها المرونة ليتم تعديلها للببتيدات الأخرى المضادة للميكروبات.

في النهاية ، يمكن أن تساعد هذه التقنية في تطوير استراتيجيات جديدة لاستخدام الببتيدات المضادة للميكروبات كعامل مضاد للفطريات في الزراعة والطب.