عالية متعددة، والتصوير فائقة الدقة من الخلايا T باستخدام مادستورم

الهدف العام من بروتوكول التصوير هذا هو تصور بروتينات متعددة في خلية T منشطة، باستخدام مجهر تحديد مواقع الجزيئات الفردية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تنشيط خلايا T، مثل التوزيع الجزيئي الفردي لـ TCR أو مكونات العنقود الدقيق. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بقدر أكبر من تعدد الإشارات مقارنة بما تحققه طرق مجهر المحلول الخاضع للإشراف الحالية.

للبدء، قم بربط الأجسام المضادة مباشرة بصبغة Alexa 647، باستخدام طقم وسم الأجسام المضادة Alexa 647، وفقاً لبروتوكول الوسم المقدم من الشركة المصنعة. قم بطرد الأجسام المضادة الموصومة مركزياً لمدة خمس دقائق عند 20,800 ×g. بعد الطرد المركزي، اجمع السائل الطافي لإزالة الأجسام المضادة المتكتلة. بعد ذلك، قم بطلاء غرف شرائح التغطية A12 بـ 250 µL من poly-l-lysine بتركيز 0.1% لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك، يتم سحب المحلول دون شطف وتجفيف الحجرات عند 65 degree celsius لمدة 30 دقيقة. قم بتحضير تخفيف من nanodiamonds الفلورية بحجم 100 nanometer أو FNDs، في PBS واحد، واختبر تخفيفات متنوعة لضمان ظهور كمية كافية من FNDs في كل مجال. قم برج FNDs المخففة باستخدام جهاز vortex لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك، قم بعملية سونكة (sonicate) للطافي الخاص بـ FND لمدة 30 ثانية عند إعداد طاقة عالٍ. قم بتحضين طافي FND الذي تم تعريضه للسونكة في غرفة غطاء شرائح A12 مطلية بـ poly-l-lyzine لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبعد غسل الغرفة خمس مرات باستخدام 1x PBS، قم بتصوير الغرفة المطلية بـ FND باستخدام تحفيز ليزر بطول موجي 647 nanometer على مجهر turf.

استخدم عدسة شيئية بقوة تكبير 100x توفر مجال رؤية بمساحة 61 في 61 ميكرون. ويُفضل أن يكون هناك ما بين 4 إلى 10 جسيمات FNDs فردية مرئية في مجال الرؤية، وذلك عند استخدام التخفيف المناسب لـ FNDs، مع وجود جسيم FND واحد على الأقل في كل ربع من مجال التصوير. وبمجرد الوصول إلى الكثافة المناسبة لـ FNDs، أضف 250 microliters من الجسم المضاد anti-CD3 إلى كل بئر.

قم بتحضين الغرفة لمدة ساعة واحدة عند 37 degree celsius أو طوال الليل عند four degree celsius. بعد التحضين، قم بإزالة المحلول من الآبار وأضف 1x PBS لمدة 30 ثانية. كرر خطوة الغسل هذه خمس مرات.

قم بطرد مركز لـ 1 mL من خلايا Jurkat T بسرعة 800 ×g لمدة ست دقائق. يفضل أن يكون تركيز خلايا Jurkat T ما بين 0.5 إلى 1 مليون خلية لكل mL قبل عملية الطرد المركزي. أعد تعليق الخلايا في 300 µL من محلول 1x HBS.

وفي هذه الأثناء، أضف 150 µL من محلول 1x HBS إلى كل بئر من آبار الغرفة واحضنها عند 37 °C لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، أضف 50 µL من خلايا Jurkat T المعاد تعليقها إلى كل بئر واحضنها لمدة ثلاث دقائق عند 37 °C. ثم أضف 300 µL من 4%paraformaldehyde إلى كل بئر واحضنها لمدة 30 دقيقة عند 37 °C.

بعد الغسل ثلاث مرات بمحلول 1x PBS، يتم نفاذ الخلايا عن طريق إضافة 250 microliters من محلول 0.1% Triton x لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبعد ثلاث عمليات غسل إضافية بمحلول 1x PBS، أضف 250 microliters من محلول 1% fish gelatin إلى كل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وأخيراً، اغسل الخلايا ثلاث مرات أخرى بمحلول 1x PBS.

أضف 200 µL من الأجسام المضادة الموّسمة بتركيز 0.1 إلى 0.5 µg/mL إلى الخلايا المثبتة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وبعد غسل الخلايا خمس مرات بمحلول 1x PBS، أضف 1 mL من محلول STORM المنظم وقم بتغطية الحجرة بشريحة زجاجية غطائية للحد من التعرض. استخدم مشابك على منصة المجهر لتثبيت حجرة الشريحة الغطائية في موضعها.

تعد هذه الخطوة حاسمة لإجراء تعدد الإرسال على نطاق واسع، حيث يجب أن يظل نفس مجال الرؤية موجوداً بعد عدة جولات من الغسيل والحضن. وباستخدام قدرة منخفضة لليزر 647 nanometer في وضع turf، حدد موقع خلية مصبوغة تحتوي على ثلاثة FNDs على الأقل في مجال الرؤية. ثم قم بزيادة قدرة ليزر 647 nanometer والتقط الصور.

يمكن العثور على المعلمات النموذجية في البروتوكول النصي. اغسل الخلايا خمس مرات باستخدام 1x tris-buffered saline أو 1x TBS. بعد ذلك، أضف واحد ملليلتر من محلول الاستخلاص (elution buffer) واحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.

كرر عملية الشطف ثلاث مرات. استخدم ظروف الشطف المحددة بالضبط وعدد مرات شطفات الإزالة اللازمة لإزالة الإشارة كما هو موضح لكل جسم مضاد. بعد ذلك، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1x TBS وأضف واحد ملليلتر من 1x PBS.

سيؤدي التنفيذ الصحيح لخطوة الشطف هذه إلى إزالة الأجسام المضادة المرتبطة مسبقاً، مما يتيح كفاءة أعلى في وسم الأجسام المضادة اللاحقة. ومن المهم استخدام TBS في عمليات الغسل لتقليل الترسيب بين خطوات الشطف. قم بإزالة اللون الضوئي من الخلايا باستخدام ليزر بطول موجي 647 nanometer وبقدرة عالية، مع استخدام ليزر بطول موجي 405 nanometer وبقدرة من 2 to 5 milliwatts لتنشيط صبغات Alexa 647 ضوئياً وهي في الحالة المظلمة.

انتظر حتى يتم تبييض جميع الإشارات المتبقية من الأجسام المضادة غير المستخلصة ضوئياً. وعادةً ما يستغرق ذلك من ثانيتين إلى خمس ثوانٍ من التعرض لليزر. قم بالتقاط صور للعينات، باستخدام إعدادات STORM بعد الاستخلاص والتبييض الضوئي، للتأكد من إزالة الإشارة.

بعد ذلك، أضف 250 µL من 4% paraformaldehyde لمدة 15 دقيقة؛ وذلك لمنع الارتباط التشابكي العكسي للجزيئات المثبتة في الخلية. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1x PBS.

كرر هذه الخطوات للوسم المتسلسل لأهداف متعددة. وأخيرًا، قم بإجراء تصحيح الانزياح ومحاذاة مجموعات الصور المتعددة كما هو موضح في البروتوكول النصي. وقد استُخدمت طريقة الوهم المتسلسل والوقوف لإنتاج صورة MET STORM متعددة الأطياف للعناقيد الدقيقة والهياكل الأخرى في خلية Jurkat T منشطة.

تم تصحيح صورة MET STORM النهائية من حيث الانزياح والمحاذاة، باستخدام تصحيح العلامات المرجعية المتوسطة وعلامات FND المرجعية. تظهر هنا صور مجهر تحديد موقع الجزيء المفرد لـ FND واحد تم تحديد موقعه في 30,000 إطار صوري قبل وبعد تصحيح الانزياح باستخدام تصحيح العلامات المرجعية المتوسطة. وبالمثل، تظهر هنا صور مجهر تحديد موقع الجزيء المفرد لخلية T من نوع Jurkat منشطة ومصبوغة بجسم مضاد لـ SLP76 المفسفر وعلامات FND المرجعية، قبل وبعد تصحيح الانزياح باستخدام تصحيح العلامات المرجعية المتوسطة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية إجراء التصوير فائق الدقة متعدد الإرسال للبروتينات في خلية T منشطة، باستخدام تقنية MET STORM. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاث ساعات لكل جولة من تعدد الإرسال. وأثناء محاولة إجراء هذا البروتوكول، من المهم تذكر الحفاظ على العينة في نفس الموضع على منصة المجهر.

يمكن القيام بذلك باستخدام مشابك المنصة. لا تنسَ أن العمل باستخدام محلول STORM المنظم المعدل قد يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء أجهزة التنفس والنظارات الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.