تعديل محطة الطرفية تقييد جزء تحليل لقياس طول تيلومير باستخدام التهجين في هلام

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد طول التيلوميرات في الخلايا حقيقية النواة باستخدام نسخة معدلة من إجراء تحليل شظايا تقييد التيلومير ، والذي وصفه الأطباء جيري دبليو شاي وودرينغ رايت وزملاؤه. من خلال توفير بيانات عن طول التيلومير ، يمكن للإجراء الإجابة على أسئلة حول بيولوجيا الخلية ، والطب السلوكي ، وعلم الأوبئة ، والأمراض المعدية ، حول آثار العمر ، والإجهاد ، والعلاجات الدوائية ، والالتهابات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر قياسا مباشرا بالكيلو قواعد لمتوسط طول التيلومير في مجموعة متنوعة من الخلايا.

تم استخراج عينات الحمض النووي الجينومي المراد تحليلها من الخلايا باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي التجارية كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بإجراء هضم الحمض النووي الجيني في حجم نهائي من 20 إلى 40 ميكرولترا. اجمع بين ما يلي في كل أنبوب طرد مركزي دقيق: ثلاثة ميكروغرام من الحمض النووي الجيني ؛ 10x عازلة هضم الحمض النووي ؛ ميكرولتر واحد من إنزيم تقييد Rsa1 ؛ ميكرولتر واحد من إنزيم تقييد Hinf1 ؛ والماء المعقم منزوع الأيونات إلى الحجم النهائي.

جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة للتأكد من أن جميع المكونات موجودة في قاع الأنبوب. احتضان الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة على الأقل. ابدأ هذا الإجراء بإعداد محلول الاغاروز 0.6٪ كما هو موضح في بروتوكول النص.

تحضير نظام الرحلان الكهربائي للهلام لصب الجل. قم بتوصيل البوابات الطرفية بصينية صب الجل. بمجرد أن يبرد محلول هلام الاغاروز إلى 50 درجة مئوية ، اسكبه في صينية صب الجل ، ضع مخروطا في الجل ، واترك الجل يتماسك لمدة 45 دقيقة مكشوفا في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة البوابات الطرفية من صينية الصب ، وقم بإزالة المشط من الجل. املأ نظام الرحلان الكهربائي للهلام ، مع عازلة الرحلان الكهربائي لخط التعبئة ، مما يضمن غمر الجل بالكامل في المخزن المؤقت. قم بتحميل آبار الجل بعينات الحمض النووي ، مع ترك بئر فارغ بين العينات.

أضف 10 ميكرولترات من سلم الحمض النووي إلى الآبار على طرفي نقيض من الجل. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي للهلام عند 150 فولت لمدة 30 دقيقة ، لنقل الحمض النووي بسرعة إلى الجل. بعد 30 دقيقة ، اضبط الجهد على 57 فولت ، وقم بتشغيله لمدة 18 إلى 24 ساعة.

بعد تشغيل الجل لمدة 18 إلى 24 ساعة ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الرحل الكهربائي وقم بإزالة صينية صب الجل مع الجل من المخزن المؤقت للرحل الكهربائي. شريحة من الزاوية اليمنى العليا من الجل لتكون بمثابة مرجع لاتجاه الجل. قص قطعة من ورق الترشيح بحجم أكبر قليلا من الجل.

ضع ورق الترشيح أعلى الجل في صينية صب ، واترك الورق يمتص المحلول الزائد على الجل. قم بإزالة فقاعات الهواء بعناية بين ورق الترشيح والهلام ، باستخدام ماصة كأسطوانة للضغط على الفقاعات من خلال الجوانب. قم بإزالة الجل من درج الصب عن طريق قلب الجل وورق الترشيح بحيث يكون الورق أسفل الجل.

انقل الجل بورق الترشيح إلى مجفف الجل ، وقم بتغطية الجل بغلاف بلاستيكي. قم بإزالة جميع فقاعات الهواء بين الغلاف البلاستيكي والهلام باستخدام ماصة كبكرة. جفف الجل على حرارة 50 درجة مئوية لمدة ساعتين.

بمجرد أن يجف الجل ، قم بإزالة الغلاف البلاستيكي وانقل الجل وورق الترشيح إلى طبق زجاجي يحتوي على 250 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بإزالة ورق الترشيح بعناية ، واحتضن الجل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ضع الجل فوق شبكة نايلون مقاس 12 × 12 بوصة.

قم بلف شبكة النايلون والهلام معا مع التأكد من أن الجل لا ملامس لنفسه. ضع الشبكة والهلام في أنبوب تهجين. امزج 100 مل من 5x SSC و 12 ميكرولترا من صبغة الحمض النووي الفلوري الأخضر ، وضعها في أنبوب التهجين.

احتضن لمدة 30 دقيقة عند 42 درجة مئوية في فرن تهجين مع دوران. حماية المحلول من الضوء. بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة شبكة النايلون والهلام من أنبوب التهجين.

افتحها وضعها بشكل مسطح في طبق زجاجي يحتوي على 250 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بإزالة شبكة النايلون برفق. قم بتصوير الجل باستخدام الفوسفور مع الإعدادات المشار إليها.

إعداد مسبار التيلومير المشع وفقا للوائح المنشأة للتعامل مع النشاط الإشعاعي. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، اجمع بين ما يلي: ميكرولترين من مسبار التيلومير. 2.5 ميكرولتر من 10x عازلة تفاعل كيناز بولي النوكليوتيدات ؛ ثلاثة ميكرولتر إلى ATP المسمى على مجموعة فوسفات جاما مع P32 ؛ أربعة ميكرولترات من كيناز بولي النوكليوتيدات T4 ؛ والماء الخالي من DNase ومعقم ومنزوع الأيونات إلى حجم نهائي يبلغ 20 ميكرولترا. باختصار الطرد المركزي الأنبوب.

احتضان الأنبوب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بالطرد المركزي للأنبوب لفترة وجيزة ، واحتضانه عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإيقاف التفاعل. قم بتحميل محلول المسبار المشع في عمود كروماتوغرافيا G25 محضر ، وجهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 700 مرة جرام.

احفظ المرشح الذي يحتوي على مسبار التيلومير المشع. ضع الجل في طبق زجاجي يحتوي على 250 مل من محلول تغيير طبيعة الشمس واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول تغيير طبيعة الجسم واستبدله ب 250 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات.

احتضن لمدة 10 دقائق على شاكر مداري في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة الماء منزوع الأيونات. استبدل ب 250 مل من محلول التحييد واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

لف الجل في شبكة من النايلون ، وضعه في أنبوب التهجين. أضف 20 مل من محلول التهجين ، واحتضنه في فرن تهجين على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع الدوران. بعد 10 دقائق ، قم بإزالة محلول التهجين واستبدله ب 20 مل من محلول التهجين الجديد.

أضف مسبار التيلومير بالكامل ، واحتضنه في فرن تهجين على حرارة 42 درجة مئوية مع الدوران طوال الليل. عند اكتمال التهجين باستخدام مسبار التيلومير ، قم بإزالة الجل والشبكة من أنبوب التهجين ، وضعه في طبق زجاجي يحتوي على 250 مل من 2x SSC. قم بفك شبكة النايلون وإزالتها من الطبق.

ضع الطبق الزجاجي على شاكر مداري واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة 2x SSC ، واستبدلها ب 250 مل من 0.1x SSC ، بالإضافة إلى محلول SDS 0.1٪ ، واحتضن لمدة 15 دقيقة على شاكر المداري في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة حل 0.1x SSC plus 0.1٪ SDS.

استبدلها ب 250 مل من 2x SSC واحتضانها لمدة 15 دقيقة أخرى على شاكر المدار. قم بإزالة الجل من 2x SSC ، ولف الجل في غلاف بلاستيكي. قم بإزالة جميع الفقاعات والجيوب الهوائية بين الجل والغلاف البلاستيكي.

ضع الجل في شريط تعريض ضوئي بشاشة فوسفورية ، وقم بتعريض شاشة الفوسفور للهلام طوال الليل. في اليوم التالي ، استخدم جهاز تصوير الفوسفور لتصوير شاشة الفوسفور المكشوفة. تستخدم صور الفوسفور لاحقا لقياس طول التيلومير كما هو موضح في بروتوكول النص.

تم تحليل ثلاثة تركيزات من الحمض النووي المعزولة من خط خلايا الخلايا الليفية للقلفة البشرية الخالدة وخلايا الدم المحيطي البشرية أحادية النواة لطول التيلومير. تظهر هذه الصورة الفوسفورية لهلام الورد المجفف الملطخ بصبغة الحمض النووي الفلوري الأخضر موقع نطاقات سلم الحمض النووي في الممرات الأولى والثامنة. يشار إلى المسافة المقاسة من أعلى الجل إلى كل معيار وزن جزيئي بأسهم زرقاء.

بعد التهجين باستخدام مسبار التيلومير ، تظهر أشرطة التيلومير على شكل لطخات في كل حارة. تم حساب شبكات من 150 صندوقا لكل حارة بالإضافة إلى حارة خلفية واحدة. يتم عرض مجالات التحليل المحددة لكل مجموعة من العينات.

تم اختيار ممرات خلفية منفصلة تحمل علامة B لكل مجموعة من العينات ، لضمان تشابه شدة الخلفية لكل مجموعة عينات. كشفت حسابات متوسط طول التيلومير عن متوسط طول التيلومير أعلى في خط الخلية الخالد منه في الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي البشري. توضح هذه النتائج أيضا أن كمية الحمض النووي الجيني التي تم تحليلها في كل حارة أمر بالغ الأهمية للحصول على إشارة يمكن اكتشافها بعد التهجين.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون 12 ساعة موزعة على 2 1/2 يوم ، مع حضانات ليلية إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام ما لا يقل عن ثلاثة ميكروغرامات من الحمض النووي لكل عينة ، وقياس كل عينة في نسختين. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الشيخوخة لاستكشاف الآليات المسؤولة عن الحفاظ على طول التيلومير في الأنواع الحيوانية المختلفة ، بما في ذلك البشر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد متوسط طول التيلوميرات نفسها مباشرة. لا تنس أن العمل مع النشاط الإشعاعي يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معاطف المختبر والقفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.