الكشف عن الخلايا السلف محمر المانحة المتبقية بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم للمرضى الذين يعانون من هيموجلوبينوباثيس

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة حالة الخيمرية (chimerism) في سياق زراعة الخلايا الجذعية. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الزراعة، مثل تقييم تطعيم زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم للمرضى الذين يعانون من اعتلالات الهيموغلوبين. تكمن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في أنها تجمع بين فرز الخلايا القائم على قياس التدفق الخلوي، ومقايسة معلومات العمود، والتحليل اللاحق للتكرارات القصيرة لتقييم تكاثر وتمايز السلائف في القسم المكون للكريات الحمراء.

تمتد تطبيقات هذه التقنية إلى علاج رفض الطعم لأنها قد تساعد في تحديد المرضى المعرضين لانتكاسة المرض وبدء استراتيجيات التعديل المناعي اللاحقة. علاوة على ذلك، يمكن تطبيقها أيضاً في الدراسات السريرية المستقبلية، وأبحاث الخلايا الجذعية، وتصميم تجارب علاج الجلد. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لأن العملية صعبة التعلم وتتطلب تنفيذها من قبل كوادر مدربة.

ستقوم إليزابيث هوفلينر، وهي فنية في مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. للبدء، قم بإعداد معلق خلوي أحادي من عينة نخاع العظم من أجل صبغ الدهون. وللقيام بذلك، ضع مصفاة خلايا تحتوي على نخاع العظم وقم بتثبيتها بالتدوير فوق أنبوب طرد مركزي.

استخدم مكبس المحقنة لدفع قطع النسيج عبر الشبكة. ولجمع كافة المواد، اشطفها ببضع مليلترات من محلول التثبيت (suspension buffer). أضف ثلاثة مليلترات من وسط التدرج (gradient medium) إلى أنبوب طرد مركزي، ثم ضع معلق الخلايا المفردة فوقه بعناية على شكل طبقة.

قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 550 G وبدرجة حرارة 20 degree celsius لمدة 30 دقيقة، مع ضبط التسريع على التسعة والتباطؤ على الصفر. أزل الطبقة العلوية التي تحتوي على البلازما والصفائح الدموية باستخدام الماصة، مع الحرص على عدم تعكير طبقة الخلايا أحادية النواة عند الواجهة الفاصلة. انقل طبقة الخلايا أحادية النواة هذه إلى أنبوب طرد مركزي.

بعد ذلك، اغسل الخلايا باستخدام 10 milliliters من محلول التعليق المنظم. قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 250 G في درجة حرارة أربع degree celsius، لمدة خمس دقائق. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في two milliliters من وسط dulbecco المعدل بواسطة isokov الكامل، عن طريق السحب بالماصة.

لتحديد تركيز الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، ضع 95 µL من صبغة trypan blue بتركيز 2% في طبق يحتوي على 96 بئراً. أضف 5 µL من معلق الخلايا، وامزجه جيداً ثم اتركه في درجة حرارة الغرفة لفترة وجيزة. املأ مقياس كرات الدم وافحصه تحت المجهر.

قم بعدّ الخلايا الحية المصبوغة فقط. بعد ذلك، قم بطرد معلق الخلايا مركزياً عند 250 G في درجة حرارة 25 degree celsius لمدة 10 دقائق. ولمنع ارتباط مستقبلات FC، استخدم 2.5 micrograms من المادة الحاجبة لكل 100 microliters.

يُحضن على الثلج لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة. تُضاف توليفة الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي تم معايرتها مسبقاً وبما يتناسب مع الحجم المستخدم لصبغ الخلايا. تُحضن العينة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية في الظلام لمدة 20 دقيقة.

اغسل الخلايا باستخدام 3 milliliters من محلول التثبيت (staining buffer)، ثم قم بالطرد المركزي. بعد ضبط تركيز الخلايا، انقل معلق الخلايا إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي القياسي، عن طريق سحب المعلق باستخدام ماصة عبر مصفاة خلايا 70 microliter لإزالة التكتلات. بعد ذلك، قم بإعداد وتحسين جهاز فرز الخلايا والبرنامج الخاص به وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بإعداد قالب يتضمن مخططاً ثنائي المتغيرات لعرض التشتت الأمامي أو FSC والتشتت الجانبي أو SSC. ولوضع مجتمع الخلايا المستهدف ضمن المقياس المناسب، قم بتمرير الخلايا عبر جهاز الفرز وضبط FSC وSSC. ابدأ بتسجيل البيانات لأنبوب الضبط السلبي، وبعد ذلك، سجل البيانات لكل أنبوب ضبط تعويض لكل صبغة منفردة واحسب قيمة التعويض.

بعد ذلك، يتم عرض العينات التجريبية على مخطط نقطي ثنائي المتغير FSC وSSC ليشمل كلًا من الخلايا اللمفاوية والخلايا النخاعية. ومن خلال مقارنة إشارات FSC المختلفة، يتم استبعاد الخلايا المزدوجة والتجمعات. ثم يتم تصوير الخلايا المفردة التي تظهر CD45 وCD36 على مخطط نقطي ثنائي المتغير.

تمثل الأحداث الإيجابية لـ CD45 الكريات البيضاء وسلفها. أما الأحداث السلبية لـ CD45 والإيجابية لـ CD36، فتمثل السلف المكونة للكريات الحمراء. ولتحديد الخلايا الإيجابية لـ CD36 والإيجابية لـ CD45، استخدم أدوات تحديد البوابات (gating tools)، ثم قم بتصور الأحداث الإيجابية لـ CD45 ومخطط نقطي آخر يعرض معايير CD34 وSSC.

بعد ذلك، استخدم أدوات تحديد البوابات (gating tools) لتعريف الخلايا الموجبة لـ CD34 أو أسلاف الكريات البيضاء، والخلايا ذات التشتت الجانبي العالي (SSC high) أو الخلايا النخاعية في مراحل مختلفة من التمايز. بعد ذلك، حدد البوابات لفرز الخلايا في أنابيب جمع خارجية. وأخيراً، تابع عملية فرز الخلايا عند درجة حرارة 4 °C حتى الحصول على العدد المطلوب من الخلايا.

قم بتخفيف الخلايا عن طريق إضافة وسط IMDM كامل مكمل بـ erythropoietant البشري المؤتلف أو EPO. انقل 300 µL من الخلايا المخففة إلى 3 mL من وسط H4434 وقم بالتحضين مع الرج في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، وزع الخلايا في ثلاثة أطباق بقطر 35 mm، بحيث يحتوي كل طبق على 1 mL من معلق الخلايا.

ضع طبقين من أطباق الزرع مع طبق ثالث مملوء بالماء في طبق سعة 100 مليمتر. ازرع هذه الخلايا في حضانة رطبة عند 37 degree celsius، مع 5%carbon dioxide لمدة 14 يوماً. استخدم مجهراً مقلوباً بتكبير 40x وطبق الزرع الملحق بشبكة تسجيل، لتقييم المستعمرات وفقاً لشكلها المورفولوجي.

صنف وحدات تكوين المستعمرات (CFU) إلى خلايا سلفية متعددة القدرات، وخلايا سلفية محببة وحيدة النواة، ووحدات تكوين انفجارية حمراء، وخلايا وحدة تكوين مستعمرات حمراء. للبدء، استعد الخلايا من جهاز الفاكس أو طبق مقايسة CFU وفقاً للبروتوكول النصي ثم ابدأ في استخلاص الـ DNA. بعد طرد الخلايا مركزياً، استخدم جهازاً آلياً لعزل الـ DNA من الدم لعزل الحمض النووي من الراسب.

قم بقياس تركيز DNA باستخدام مقياس الفلورية. جهز العينات وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، ثم ضع العينة في غرفة العينات الخاصة بمقياس الفلورية. أضف DNA المُخفف إلى مزيج من DNA polymerase ومجموعة البادئات ومزيج التفاعل لإعداد تفاعل PCR وفقاً للدليل الإرشادي.

قم بتضمين الحمض النووي (DNA) المأخوذ قبل الزرع من المانح والمستقبل، بالإضافة إلى ماء خالٍ من النوكلياز كضابط سلبي، بينما يمثل 9947A ضابطاً إيجابياً. ولتحليل نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، أضف 10 µL من عينات الحمض النووي (DNA) الممسوخة إلى آبار لوحة تفاعل ذات 96 بئراً. أغلق اللوحة بإحكام، ثم قم بطرد مركزي وجيز وضع اللوحة على الثلج.

تم فرز السلائف المكونة للكريات الحمراء والمكونة للصفيحات الدموية كجمهرة موجبة للمستضد CD36 وسالبة للمستضد CD45. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد الخلايا الموجبة لـ CT45 والموجبة لـ CD34 على أنها سلائف نخاعية لمفاوية، بينما تم تحديد الخلايا الموجبة لـ CD45 ذات إشارة SSC العالية على أنها خلايا نخاعية ناضجة. كانت نقاوة الخلايا السلفية المكونة للكريات الحمراء بعد الفرز أكثر من 85%، بينما كانت نقاوة الخلايا النخاعية أكثر من 95%. وقد تم استزراع خلايا نخاع العظم المفصولة باستخدام حبيبات مغناطيسية متخصصة لـ CD34 لمدة 14 يوماً.

يبدو أن بعض هذه الخلايا تتكاثر وتتمايز وتُشكل مستعمرات. وقد أدى التحفيز بتركيزات مختلفة من EPO إلى زيادة تكوين مستعمرات حمراء دموية ذات لون أحمر بارز. ويمكن لتحليل PCR للتكرارات الترادفية القصيرة أو STRs الخاصة بالحمض النووي للمستقبل والمتبرع الكشف عن حالة الخيمرية (chimerism) في الخلايا.

نجحت هذه الطريقة في تحديد كمية الحمض النووي للمستقبل مقابل المانح في الخلايا التي تم الحصول عليها من فرز خلايا نخاع العظم، وكذلك في الخلايا التي تم الحصول عليها من مقايسة تشكيل المستعمرات. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون أربع ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وعند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن هذه التقنية تتطلب توحيداً معياريًا وأن يتم تنفيذها بواسطة كوادر مدربة تدريباً مناسباً.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تحليل الخلايا السلفية المكونة للدم المتبقية والمشتقة من المتبرع للإجابة على أسئلة إضافية، مثل الميزة الانتقائية للخلايا الجذعية المكونة للدم المصححة وراثياً. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال زراعة الخلايا الجذعية لاستكشاف تكاثر وتمايز الخلايا السلفية في القسم المكون للدم. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية مراقبة الانغراس بعد زراعة الخلايا الجذعية في المرضى الذين يعانون من اعتلالات الهيموغلوبين.