تطبيق الآلي صورة موجهة المشبك التصحيح لدراسة الخلايا العصبية في شرائح الدماغ
July 31st, 2017
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء التلقائية الموجهة تصويرا التصحيح المشبك التجارب باستخدام نظام وضعت مؤخرا للمعايير في المختبر الكهربية المعدات.
الهدف العام لهذه التقنية هو استخدام رؤية الكمبيوتر للكشف التلقائي عن الخلايا الفلورية وإجراء مشبك التصحيح الآلي لهذه الخلايا في شرائح الدماغ الحادة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في التغلب على الصعوبات الرئيسية في مجال الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح ، مثل تحديد الخلايا ذات العلامات الفلورية واستهدافها ومشبك التصحيح. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تكتشف تلقائيا ماصات التصحيح وخلايا الفلورسنت ودمج الخطوات مع مشبك التصحيح التلقائي.
يزيد هذا الابتكار بشكل كبير من الإنتاجية التجريبية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج أو تشخيص الاضطرابات العصبية ، لأنه يمكن استخدام مشبك التصحيح الأوتوماتيكي الموجه بالصور عالي الإنتاجية للفحوصات الدوائية في المزيد من المستحضرات العصبية الفسيولوجية. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على المستحضرات الأخرى في المختبر ، مثل الثقافات العصبية العضية العصبية ، أو الثقافات الشرائحية ، وفصل الخلايا العصبية وكذلك أي خلايا غير عصبية.
لبدء هذا الإجراء ، قم بتشغيل مكبر الصوت ووحدة التحكم في المجهر ووحدة التحكم في المناويل. بعد ذلك، قم بتشغيل Autopatcher IG مع python من محطة سطر الأوامر عن طريق تغيير الدليل حيث تم تثبيت Autopatcher IG أولا. بعد ذلك ، اكتب Python Autopatcher_IG.
PYW في محطة سطر الأوامر واضغط على مفتاح الإدخال. بعد ذلك ، املأ كل الماصة الزجاجية بمحلول داخلي وقم بتحميلها على مرحلة الرأس. حرك طرف الماصة إلى المجال البصري للمجهر وجعله في بؤرة التركيز.
إذا تم استخدام لوحة الاتصال لتحريك المتلاعبين في مرحلة المجهر، فقم بتحديث الإحداثيات بالضغط على Z على لوحة المفاتيح. تقوم المعايرة الأولية بتحويل زاوية ومسافة الحركة بواسطة المناور إلى نظام إحداثيات المجهر. يتحرك المناور في ثلاثة اتجاهات بمسافة محددة مسبقا ويكتشف البرنامج إحداثيات طرف الماصة داخل المجال البصري للمجهر.
انقر فوق زر بدء المعايرة في واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية للوحدة المقابلة التي يتم تحميل الماصة عليها. بعد ذلك ، احفظ المعايرة بالنقر فوق حفظ المعايرة في الجزء السفلي من واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية. هذه المعايرة الأولية ضرورية فقط لإجراء مرة واحدة ما لم يتم تغيير التنظيم المادي للجهاز.
في هذه الخطوة ، ضع شريحة دماغ واحدة في وسط غرفة التسجيل. قم بتثبيت شريحة الدماغ بشريحة باستمرار أو قيثارة. للكشف عن الخلية الفلورية ، أوجد منطقة الاهتمام تحت التكبير أربع مرات.
بعد ذلك ، حرك مرحلة المجهر عن طريق تشغيل وضع النقر للنقل والنقر فوق مركز منطقة الاهتمام. بدلا من ذلك ، استخدم لوحة المفاتيح لتحريك مرحلة المجهر. بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى عدسة التكبير العالية واضبط التركيز عن طريق تحريك المجهر في المحور Z باستخدام التردد اللاسلكي على لوحة المفاتيح.
يوجه البرنامج المجهر والكاميرا لالتقاط سلسلة من الصور على أعماق مختلفة. بعد ذلك ، تخضع هذه الصور لمعالجة رؤية الكمبيوتر للعثور على خلايا ذات علامات فلورسنت. الإخراج النهائي هو قائمة بإحداثيات الخلايا المكتشفة.
انقر فوق زر الكشف عن الخلية في وحدة عمود واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية صفر. إذا تعذر التحكم في مصدر ضوء LED أو الليزر للإعداد بواسطة إشارة TTL ، فقم بتشغيل مؤشر LED أو الليزر يدويا. قم بإيقاف تشغيل LED أو الليزر إذا لزم الأمر.
ستظهر قائمة بإحداثيات الخلية في واجهة المستخدم الرسومية (GUI) لمواضع الذاكرة. قم بإزالة الخلايا غير المرغوب فيها من القائمة بالنقر فوق الزر X بجوار الإحداثيات. بدلا من ذلك، إذا لم يتم تسمية الخلايا المستهدفة بالفلورسنت، فانقر فوق وضع الماوس على واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية.
ثم انقر فوق الخلية محل الاهتمام ، وستظهر نقطة صفراء برقم على الخلية وستظهر إحداثيات الخلية في مواضع الذاكرة واجهة المستخدم الرسومية. لإجراء المعايرة الثانوية للكشف عن إحداثيات إزاحة الماصة، املأ 1/3 من الماصة الزجاجية بمحلول داخلي. بعد ذلك، قم بتحميل الماصة على حامل الماصة المتصل بمرحلة الرأس.
عند التكبير المنخفض، استخدم واحدا واثنين على لوحة المفاتيح للتبديل بين الوحدة الأولى والوحدة الثانية. بعد ذلك ، أحضر الماصة إلى المجال المرئي واضبط التركيز باستخدام لوحة المفاتيح. بعد ذلك ، قم بتحميل المعايرة الأساسية بالنقر فوق معايرة الحمل.
قم بتبديل عدسة المجهر إلى التكبير العالي وانقر 40 مرة على واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية. أحضر طرف الماصة إلى المنتصف. ثم انقر فوق زر المعايرة الثانوية على واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية، أسفل الوحدة المستخدمة.
لتصحيح خلية مستهدفة ، انقر فوق زر التحكم في التصحيح لفتح واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في التصحيح. انقر فوق الزر الانتقال إلى بجوار الخلية محل الاهتمام في قائمة الإحداثيات في واجهة المستخدم الرسومية (GUI) لموضع الذاكرة. بعد ذلك ، انقر فوق الزر CTM للوحدة في واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية لتمكين الحركة.
انقر فوق الخلية محل الاهتمام لنقل طرف الماصة إلى الخلية. نظرا للقيود الميكانيكية للمناور ، عند السفر لمسافة أطول من 500 ميكرومتر ، قد يكون هناك خطأ طفيف في تحديد المواقع. لمنع حدوث خطأ كبير في تحديد المواقع الميكانيكية ، يجب إجراء المعايرة الثانوية بالقرب من الخلية المستهدفة.
بعد ذلك ، استخدم الوحدة زر واحد محدد لتبديل إشارة الإدخال بين الوحدتين. انقر فوق زر التصحيح في واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في التصحيح. سيبدأ الترقيع التلقائي ويمكن مراقبة الضغط والمقاومة على واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في التصحيح.
تراقب خوارزمية التصحيح الأوتوماتيكية المقاومة وتتحكم في الضغط من خلال سلسلة من الحلقات المنطقية ، لتشكيل جيجاسيل. تخطر النافذة المنبثقة بتكوين gigaseal. يستخدم النظام تغيير المقاومة للتعرف على ملامسة سطح الخلية.
في حالة عدم اكتشاف ملامسة سطح الخلية في الوقت المناسب ، استخدم الزر التالي للتقدم في مرحلة الترقيع مع البقاء في نفس تجربة الترقيع التلقائية. قم بمعالجة العملية التلقائية في أي وقت من خلال النقر على الأزرار المعنية في واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في التصحيح. ثم حدد نعم للاقتحام مع Zap والشفط المدمجين.
بدلا من ذلك ، حدد لا للاقتحام بالشفط فقط. ثم احفظ سجل تصحيح التجربة. يوضح هذا الشكل المواقع المحددة التي تم تحميلها إلى واجهة المستخدم الرسومية لتسلسل الأوامر.
يعرض العمود الأيسر قائمة الإحداثيات ويعرض العمود الأيمن قائمة الأوامر في شكل إشارات TTL لكل موقع. فيما يلي لقطات الشاشة أثناء تجربة تطبيق الدواء ، المقابلة للمواقع الثلاثة المحددة. تم خلط محلول KCL مع صبغة الفلورسنت الحمراء لغرض التصور.
كانت الوحدة الأولى عبارة عن الماصة المحتوية على KCL والوحدة الثانية كانت ماصة الترقيع. في هذا الشكل ، تظهر الحقن الحالية للخطوة خلية عصبية متصاعدة منتظمة. تظهر هنا آثار تسجيل مشبك الجهد من التطبيق المحلي لمحلول كلوريد البوتاسيوم 500 مللي مولار في ثلاثة مواقع.
تم تسجيل الأثر الأحمر مع التيار الداخلي من التجربة عندما كان تطبيق كلوريد البوتاسيوم قريبا من خلية التصحيح. يشير السهم الأحمر إلى توقيت استخدام كلوريد البوتاسيوم. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمرء إجراء تجربة مشبك التصحيح في غضون أربع دقائق دون تدريب مكثف مقارنة بالترقيع اليدوي.
باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل علم البصريات الوراثي وعلم العلاج الكيميائي والتلاعب الدوائي من أجل الإجابة على الأسئلة المتعلقة بمشروعك البحثي. بعد تطويرها ، قد تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف الدراسات عالية الإنتاجية للمستقبلات المشبكية والقنوات الأيونية في الاستعدادات المختلفة في المختبر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجارب مشبك التصحيح الآلي الموجه بالصور.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة لإجراء تجارب رقعة ضغطية موجهة بالصور باستخدام تقنية رؤية الكمبيوتر المتقدمة. يعزز هذا النهج كفاءة تحديد واستهداف الخلايا الموسومة بالفلورة في شرائح الدماغ الحادة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الفيزيولوجيا الكهربية
- علم الأعصاب
- تقنيات التصوير
الخلفية
- الفيزيولوجيا الكهربية للرقعة الضغطية ضرورية لدراسة النشاط العصبي.
- يمكن أن يكون تحديد واستهداف خلايا معينة تحديًا.
- يمكن أن تحسن التقنيات الآلية الإنتاجية التجريبية.
- تساعد الوسم الفلوري في تحديد الخلايا.
هدف الدراسة
- لأتمتة اكتشاف الخلايا الفلورية لتجارب الرقعة الضغطية.
- لزيادة كفاءة التسجيلات الكهربية الفسيولوجية.
- لتيسير الفحوصات الدوائية في المستحضرات العصبية.
الطرق المستخدمة
- تقنية رؤية الكمبيوتر لاكتشاف الخلايا.
- إعداد رقعة ضغطية آلي للتسجيل.
- دمج عمليات الاكتشاف والتسجيل.
- التطبيق على مختلف المستحضرات العصبية في المختبر.
النتائج الرئيسية
- الأتمتة الناجحة لتحديد الخلايا ورقعة الضغطية.
- زيادة الإنتاجية للتجارب الكهربية الفسيولوجية.
- تطبيقات محتملة في البحث الدوائي.
- تنوع في التطبيق على أنواع مختلفة من الخلايا.
الاستنتاجات
- تعزز هذه التقنية بشكل كبير من كفاءة التجربة.
- تعالج التحديات الرئيسية في طرق الرقعة الضغطية التقليدية.
- للنهج آثار على أبحاث الاضطرابات العصبية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Automated image-guided patch clamp addresses throughput limitations in neuronal electrophysiology, enabling scalable functional validation of ion channel and synaptic receptor targets. This capability supports early discovery workflows by reducing technical variability and increasing data density for lead identification campaigns. The method enhances predictive confidence in target validation by providing quantitative, reproducible electrophysiological readouts from physiologically relevant neuronal preparations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of neuronal excitability and synaptic properties in fluorescently labeled cells.
- Operational Value: Reduces reliance on expert operators, standardizing patch clamp execution across users and sites.
- Predictive Value: Increases data yield per experiment, supporting statistical rigor in target engagement and mechanism of action studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized neuronal preparations suitable for downstream pharmacological and genetic screening campaigns.
- Quantitative Output: Provides real-time resistance and pressure metrics that enable automated seal formation detection and process optimization.
- Scalability: Supports multiplexed targeting of multiple cells per slice, increasing experimental density without proportional increases in operator time.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of neuronal phenotypes in acute brain slices, maintaining native circuitry and pathophysiological context.
- Translational Continuity: Bridges discovery electrophysiology with preclinical validation by enabling consistent readouts across model systems.
- Mechanistic De-risking: Allows direct assessment of compound effects on ion channel function and neuronal firing patterns in intact tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows as a functional validation step following target identification and preceding lead optimization, providing electrophysiological confirmation of target engagement in native neuronal environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling automated, high-fidelity recording of neuronal activity in response to pharmacological or genetic perturbations.
- Screening: Enhances assay reproducibility and throughput, allowing systematic evaluation of compound libraries on neuronal excitability and synaptic transmission.
- Analytics: Delivers quantitative electrophysiological readouts (e.g., spike frequency, input resistance, current-voltage relationships) that inform structure-activity relationships and target selectivity.
- Translational Research: Maintains physiological relevance by recording from neurons in acute brain slices, preserving native expression profiles and microenvironmental cues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology capability applicable across neuroscience discovery programs targeting ion channels, GPCRs, and synaptic proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through direct, quantitative measurement of neuronal function in physiologically relevant preparations.
- Operational Value: Increases experimental throughput and reduces variability via automation of cell detection, targeting, and patch execution.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions by generating robust functional data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed electrophysiological modulation in disease-relevant neuronal circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, computer vision integration, and micromanipulator operation for system setup and troubleshooting.
- Dependent on stable fluorescence labeling, appropriate patch pipette preparation, and environmental control for healthy slice maintenance.
- Necessitates standardized software protocols and calibration procedures to ensure reproducibility across experiments and users.
- Adaptation to non-neuronal or dissociated cell types may require adjustments to detection algorithms and patching parameters.
- Practical limitations include mechanical positioning errors at extended travel distances and dependency on optimal fluorescent signal-to-noise ratios for reliable cell detection.
