تطبيق الآلي صورة موجهة المشبك التصحيح لدراسة الخلايا العصبية في شرائح الدماغ

الهدف العام من هذه التقنية هو استخدام الرؤية الحاسوبية للكشف التلقائي عن الخلايا الفلورية وإجراء تثبيت الرقعة (patch clamp) الآلي لهذه الخلايا في شرائح الدماغ الحادة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في التغلب على صعوبات رئيسية في مجال الفيزيولوجيا الكهربائية القائمة على تثبيت الرقعة، مثل تحديد واستهداف وإجراء تثبيت الرقعة للخلايا الموصومة فلورياً. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتها على الكشف التلقائي عن ماصات التثبيت والخلايا الفلورية، ودمج هذه الخطوات مع عملية تثبيت الرقعة الآلية.

يزيد هذا الابتكار من الإنتاجية التجريبية بشكل كبير. وتمتد تطبيقات هذه التقنية نحو علاج أو تشخيص الاضطرابات العصبية، حيث يمكن استخدام تقنية تثبيت الجهد التلقائية الموجهة بالصور ذات الإنتاجية العالية في عمليات الفحص الدوائي في تحضيرات عصبية أكثر محاكاة للحالة الفسيولوجية. كما يمكن تطبيق هذه الطريقة على تحضيرات أخرى في المختبر، مثل المستنبتات العضوية العصبية، أو مستنبتات الشرائح، والعصبونات المنفصلة، بالإضافة إلى أي خلايا غير عصبية.

لبدء هذا الإجراء، قم بتشغيل المضخم، ووحدة التحكم في المجهر، ووحدة التحكم في الملاعب. بعد ذلك، قم بتشغيل Autopatcher IG باستخدام python من واجهة سطر الأوامر عن طريق تغيير الدليل الذي تم تثبيت Autopatcher IG فيه أولاً. ثم اكتب Python Autopatcher_IG.

اكتب PYW في واجهة سطر الأوامر واضغط على مفتاح Enter. بعد ذلك، قم بتعبئة الماصة الزجاجية بالكامل بالمحلول الداخلي وثبتها في مرحلة الرأس. حرك طرف الماصة إلى المجال البصري للمجهر واضبط التركيز.

إذا تم استخدام لوحة الاتصال لتحريك الملاقط في منصة المجهر، فقم بتحديث الإحداثيات بالضغط على مفتاح Z في لوحة المفاتيح. تقوم المعايرة الأولية بتحويل زاوية ومسافة تحرك الملقط إلى نظام إحداثيات المجهر. يتحرك الملقط في ثلاثة اتجاهات بمسافة محددة مسبقاً، ويقوم البرنامج برصد إحداثيات طرف الماصة ضمن المجال البصري للمجهر.

انقر على زر بدء المعايرة (start calibration) في واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية للوحدة المقابلة التي تم تحميل الماصة عليها. بعد ذلك، احفظ المعايرة بالنقر على حفظ المعايرة (save calibration) في أسفل واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية. من الضروري إجراء هذه المعايرة الأولية مرة واحدة فقط، ما لم يتم تغيير التنظيم المادي للجهاز.

في هذه الخطوة، ضع شريحة دماغية واحدة في مركز غرفة التسجيل. قم بتثبيت الشريحة الدماغية باستخدام مثبت شرائح أو قيثارة تثبيت. وللكشف عن الخلية الفلورية، ابحث عن المنطقة المطلوبة تحت تكبير أربعة مرات.

بعد ذلك، قم بتحريك منصة المجهر عن طريق تفعيل وضع "النقر للتحريك" والنقر على مركز المنطقة المطلوبة. بدلاً من ذلك، استخدم لوحة المفاتيح لتحريك منصة المجهر. بعد ذلك، انتقل إلى العدسة ذات التكبير العالي واضبط التركيز عن طريق تحريك المجهر في المحور Z باستخدام RF على لوحة المفاتيح.

يقوم البرنامج بتوجيه المجهر والكاميرا لالتقاط سلسلة من الصور عند أعماق مختلفة. بعد ذلك، تخضع هذه الصور لمعالجة الرؤية الحاسوبية للعثور على الخلايا الموسومة فلوريًا. والمخرج النهائي عبارة عن قائمة بإحداثيات الخلايا المكتشفة.

انقر على زر كشف الخلية (detect cell) في العمود الرئيسي لواجهة المستخدم الرسومية (GUI) للوحدة صفر. إذا تعذر التحكم في مصدر ضوء LED أو الليزر في الجهاز بواسطة إشارة TTL، فقم بتشغيل LED أو الليزر يدويًا. أوقف تشغيل LED أو الليزر إذا لزم الأمر.

ستظهر قائمة بإحداثيات الخلايا في واجهة المستخدم الرسومية لمواقع الذاكرة. قم بإزالة الخلايا غير المرغوب فيها من القائمة بالنقر على زر X الموجود بجوار الإحداثيات. بدلاً من ذلك، إذا لم تكن الخلايا المستهدفة موسومة فلوروسنتياً، فانقر على وضع الماوس في واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية.

بعد ذلك، انقر على الخلية المطلوبة، ستظهر نقطة صفراء وعليها رقم على الخلية وستظهر إحداثيات الخلية في واجهة المستخدم الرسومية لمواقع الذاكرة. ولإجراء معايرة ثانوية من أجل اكتشاف إحداثيات إزاحة الماصة، املأ 1/3 من الماصة الزجاجية بالمحلول الداخلي. ثم، قم بتركيب الماصة في حامل الماصة المتصل بمسرح الرأس.

عند استخدام تكبير منخفض، استخدم المفتاحين واحد واثنان في لوحة المفاتيح للتبديل بين الوحدة الأولى والوحدة الثانية. بعد ذلك، قم بجلب الماصة إلى مجال الرؤية واضبط التركيز باستخدام لوحة المفاتيح. ثم، قم بتحميل المعايرة الأساسية بالنقر فوق تحميل المعايرة.

قم بتحويل عدسة المجهر إلى التكبير العالي وانقر 40 مرة على واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية. ضع طرف الماصة في المركز. بعد ذلك، انقر فوق زر المعايرة الثانوي في واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية، أسفل الوحدة المستخدمة.

لتنفيذ عملية الرقع (patch) لخلية مستهدفة، انقر فوق زر التحكم في الرقع لفتح واجهة مستخدم التحكم في الرقع. انقر فوق زر الانتقال (go to) الموجود بجانب الخلية المطلوبة في قائمة الإحداثيات ضمن واجهة مستخدم موضع الذاكرة. بعد ذلك، انقر فوق زر CTM الخاص بالوحدة في واجهة المستخدم الرئيسية لتمكين الحركة.

انقر فوق الخلية المطلوبة لنقل طرف الماصة إلى الخلية. نظرًا للمحددات الميكانيكية للمناور، قد يحدث خطأ طفيف في تحديد الموقع عند الانتقال لمسافة تزيد عن 500 micrometer. ولمنع حدوث خطأ ميكانيكي كبير في تحديد الموقع، يجب إجراء معايرة ثانوية بالقرب من الخلية المستهدفة.

بعد ذلك، استخدم الزر المحدد للوحدة الواحدة (unit one selected) للتبديل بين إشارة الإدخال للوحدتين. انقر فوق زر الرقع (patch) في واجهة مستخدم التحكم في الرقع (patch control GUI). ستبدأ عملية الرقع التلقائية، ويمكن مراقبة الضغط والمقاومة عبر واجهة مستخدم التحكم في الرقع.

تراقب خوارزمية الرقع الآلية المقاومة وتتحكم في الضغط من خلال سلسلة من حلقات المنطق، وذلك لتكوين سدادة عملاقة (gigaseal). وتعمل نافذة منبثقة على الإخطار بتكوين السدادة العملاقة. ويستخدم النظام التغير في المقاومة للتعرف على التلامس مع سطح الخلية.

في حال عدم اكتشاف التلامس مع سطح الخلية في الوقت المناسب، استخدم الزر "التالي" (next) للانتقال إلى مرحلة التثبيت (patching stage) مع البقاء في نفس محاولة التثبيت التلقائية. يمكنك التحكم في العملية التلقائية في أي نقطة عن طريق النقر على الأزرار المقابلة في واجهة مستخدم التحكم في التثبيت (patch control GUI). بعد ذلك، اختر "نعم" (yes) للتدخل باستخدام مزيج من الصدمة الكهربائية (Zap) والشفط.

بدلاً من ذلك، اختر "لا" للبدء باستخدام الشفط فقط. ثم، قم بحفظ سجل رقعة التجربة. يوضح هذا الشكل المواقع المختارة التي تم تحميلها في واجهة المستخدم الرسومية لتسلسل الأوامر.

يظهر العمود الأيسر قائمة الإحداثيات بينما يظهر العمود الأيمن قائمة الأوامر في شكل إشارات TTL لكل موقع. فيما يلي لقطات شاشة أثناء تجربة تطبيق الدواء، والتي تقابل المواقع الثلاثة المختارة. تم خلط محلول KCL مع صبغة فلورية حمراء لأغراض التصوير المرئي.

كانت الوحدة الأولى هي الماصة التي تحتوي على KCL والوحدة الثانية هي ماصة التثبيت (patching pipet). في هذا الشكل، تُظهر حقنات التيار المدرجة عصبوناً ذا نشاط تشنجي منتظم. تظهر هنا آثار تسجيلات تثبيت الجهد الناتجة عن التطبيق الموضعي لمحلول كلوريد البوتاسيوم بتركيز 500 millimolar في ثلاثة مواقع.

تم تسجيل الأثر الأحمر الذي يظهر تياراً داخلياً من التجربة التي كان فيها تطبيق كلوريد البوتاسيوم قريباً من خلية الرقعة. يشير السهم الأحمر إلى توقيت تطبيق كلوريد البوتاسيوم. وباستخدام هذه الطريقة، يمكن إجراء تجربة تثبيت الرقعة في غضون أربع دقائق دون الحاجة إلى تدريب مكثف مقارنةً بالتثبيت اليدوي.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل علم البصريات الوراثي، وعلم الكيمياء الوراثي، والتلاعبات الدوائية، من أجل الإجابة على الأسئلة المتعلقة بمشروعك البحثي. وبعد تطويرها، قد تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علوم الأعصاب لاستكشاف الدراسات عالية الإنتاجية للمستقبلات المشبكية والقنوات الأيونية في تحضيرات مخبرية مختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجارب تثبيت الرقعة المؤتمتة الموجهة بالصور.