مرنا إنتيراكتوم التقاط من بروتوبلاستس النبات

الهدف العام من التقاط mRNA interactome المحسن هو عزل وتحديد البروتين المرتبط ب mRNA من الخلايا النباتية. يتم تطبيق هذه الطريقة على البروتوبلاستيات المتوسطة لأوراق الأرابيدوبسيس الثاليانا، وهو نوع خلية يستخدم كأداة متعددة الاستخدامات في المقايسات الخلوية المختلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال غرسات تنظيم الجينات بعد النسخ مثل اكتشاف وفهم دور بروتينات ربط الحمض النووي الريبي للرسل النباتي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تعزل وتتعرف على رسول نبات على بروتين مرتبط مباشرة من البيئة الفسيولوجية. لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للبروتين المرتبط بالحمض النووي الريبي المرسال من البروتوبلاستات المتوسطة لأوراق aribidopsis. يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مثل البروتوبلاست أو الأنسجة النباتية الأخرى.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا أنه تم تطبيقها بنجاح على خطوط خلايا الخميرة والثدييات. عزل البروتوبلاستات المتوسطة لأوراق الأرابيدوبسيس لعينتين مختلفتين ، كما هو موضح في بروتوكول النص. احتفظ بعينة التحكم التي لن تكون متشابكة بالأشعة فوق البنفسجية أو عينة غير CL على الجليد.

انقل معلق البروتوبلاست ليتم ربطه ، أو عينة CL إلى طبق بتري كبير. أضف 30 مل من محلول MMG المثلج إلى الطبق لتغطية السطح ونشر الخلايا عن طريق سحب العينة اللطيف. قم بتغطية طبق بتري بورق الألمنيوم عند نقله إلى جهاز التشابك بالأشعة فوق البنفسجية.

ضع طبق بتري المفتوح في جهاز تشابك للأشعة فوق البنفسجية على الفور. تأكد من أن المسافة بين الطبق ومصباح الأشعة فوق البنفسجية ثمانية سنتيمترات ثم قم بإشعاع العينة لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، قم بنقل تعليق البروتوبلاست بسرعة من طبق بتري إلى أنبوبين جديدين مستديرين سعة 50 مل.

اغسل قاع الطبق بخمسة ملليلتر إضافي من محلول MMG المثلج لجمع ما تبقى من البروتوبلاستات. قسم التعليق بين الأنبوبين. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لأنبوبي عينة غير CL واثنين من أنابيب العينة CL عند 100 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد التخلص من المادة الطافية ، ضع الأنبوب مع الحبيبات غير CL مرة أخرى على الجليد. أضف 10 مل من محلول MMG المثلج إلى كل أنبوب عينة CL وقم بهز الأنابيب برفق لإعادة تعليق الكريات. بعد الجمع بين العينتين في أنبوب دائري القاع سعة 50 مليلتر ، يتم استخدام جهاز الطرد المركزي عند 100 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد التخلص من المادة الطافية ، احتفظ بالحبيبات على الجليد. ثم أضف تسعة ملليلتر من المخزن المؤقت المرتبط بالتحلل المثلج البارد إلى حبيبات الخلية لكل عينة. قم بتحليل البروتوبلاستات عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل حوالي عشرين مرة ، حتى يصبح المحلول لونه أخضر فاتح متجانس.

من أجل التجانس ، قم بتمرير محللة البروتوبلاست مرتين من خلال حقنة زجاجية سعة 50 مليلتر بإبرة ضيقة ، ثم احتضن المحللة على الجليد لمدة عشر دقائق. قم بتجميد العينات في النيتروجين السائل وتخزينها على درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع. بعد إذابة الأنبوب باستخدام محللة البروتوبلاست المجمدة في درجة حرارة الغرفة ، احتفظ بالأنبوب على الجليد.

Aliquot 1.8 مل من الخرز المغناطيسي oligo-d (T) في ستة أنابيب طرد مركزي صغيرة جديدة مستديرة القاع ملليلتر موضوعة على الجليد. اغسل معلق الخرزة في كل أنبوب بسعة 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط التحلل عن طريق سحب الخرزات لأعلى ولأسفل لفترة وجيزة وتدوير الخرزات برفق على محور دوار لمدة دقيقتين. احتفظ بالخرز على الجليد.

بعد ذلك ، ضع جميع الأنابيب الستة التي تحتوي على الخرزات في رف مغناطيسي لمدة ثلاث دقائق على الأقل لإتاحة الوقت الكافي للالتقاط المغناطيسي الكامل. عندما يتم التقاط الخرزات بالكامل ، سيصبح التعليق واضحا. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية من جميع الأنابيب الستة وقم على الفور بإدخال تسعة ملليلتر من محللات البروتوبلاست فيها.

امزج الخرزات مع المحللة عن طريق الماصة حتى يظهر المعلق بنيا ومتجانسة. احتضان الأنابيب عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة مع دوران لطيف. بعد الحضانة ، ضع الأنابيب مرة أخرى في الرف المغناطيسي لمدة ثلاث دقائق.

عندما يتم التقاط جميع الخرزات على جانب الأنابيب ، اجمع المادة الطافية التي تحتوي على محللة البروتوبلاست في ستة أنابيب طرد مركزي صغيرة مستديرة القاع سعة ملليلترين جديدة. بعد ذلك ، أضف 1.5 مل من المخزن المؤقت للغسيل المثلج البارد واحدا إلى كل أنبوب يحتوي على خرز ، وأعد تعليق الخرزات عن طريق سحب العينات. بعد الدوران اللطيف لمدة دقيقة واحدة ، ضع الأنابيب مرة أخرى في الرف المغناطيسي لمدة ثلاث دقائق.

تخلص من المادة الطافية وكرر خطوة الغسيل هذه مرة واحدة. باستخدام 1.5 مل من المخزن المؤقت للغسيل المثلج البارد اثنين ، كرر نفس إجراء الغسيل مرتين. إذا تم عزل mRNP بكفاءة عن محللة البروتوبلاست ، فيجب أن تكون هناك هالة مرئية حول حبيبات الخرزة في عينة CL.

أخيرا ، كرر إجراء الغسيل مرة واحدة باستخدام 1.5 مل من محلول الملح المثلج البارد. بعد الغسيل ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الشطف إلى كل أنبوب ، وأعد تعليق الخرزات برفق عن طريق سحب العينات. احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق لتحرير الحمض النووي الريبي ذو الذيل poly-A.

أعد تعليق الخرزات برفق عن طريق سحب العينات مرة واحدة وأعد الأنابيب إلى الرف المغناطيسي عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. انقل ودمج المواد المزيدات من جميع الأنابيب الستة في أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 مليلتر يوضع على الجليد. سينتج عن ذلك ما يقرب من ثلاثة ملليمترات من مادة السوء.

يمكن تحديد جودة وكمية الحمض النووي الريبي على الفور باستخدام مقياس الطيف الضوئي. قم بإعداد حبات oligo-d (T) لإعادة استخدامها عن طريق غسلها مرتين باستخدام مليلتر واحد من محلول الشطف المثلج. بعد ذلك ، اغسلها بملليلتر واحد من محلول ربط التحلل المثلج البارد لضبط تركيز الملح مرة أخرى إلى 500 ملليمول.

استخدم حبات oligo-d (T) المغسولة هذه لتكرار إجراءات الربط والغسيل والشطف لجولتين إضافيتين. سيؤدي ذلك إلى استنفاد الحمض النووي الريبي ذو الذيل poly-A من محللة البروتوبلاست وينتج إجمالي تسعة ملليمترات من المواد لكل عينة. يمكن تخزين الخرز واستخدامه في تجربة أخرى لمدة أقصاها ثلاث مرات.

لاختبار جودة الحمض النووي الريبي ، قم بهضم البروتينات المتشابكة بالأشعة فوق البنفسجية بمحلول البروتيناز K وفقا لبروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بتنقية الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي لإزالة أي ملوثات متبقية. بعد التنقية ، تكون العينات جاهزة لاختبار جودة الحمض النووي الريبي باستخدام qRT-PCR.

ابدأ بمعالجة ثمانية ملليلتر من كل عينة ب 100 وحدة من كوكتيل RNAse يحتوي على RNAse A و RNAse T1. بعد دوامة قصيرة ، احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. لتركيز بروتينات ربط mRNA ، أو mRBP ، قم بتصفية العينات باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي. ستنتج كل عينة 75 ميكرولترا مع ميكروغرامين من البروتين.

للتخزين طويل الأجل ، قم بتجميد العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتشغيل جل صفحة SDS، امزج 25 ميكرولترا من كل عينة مركزة مع 15 ميكرولترا من صبغة التحميل 2X وقم بتسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. قم بتحميل العينات في علامة بروتين على جل صفحة SDS مع جل تكديس بنسبة خمسة بالمائة وهلام للحل اثني عشر بالمائة.

بعد ذلك ، اغسل الجل مرتين بالماء فائق النقاء لمدة خمس دقائق لكل غسلة. استخدم مجموعة تلطيخ الفضة التجارية لتلطيخ الجل. إذا تم استخدام العدد الكافي من البروتوبلاستات الأولية ، فستظهر نطاقات البروتين في غضون خمس دقائق.

لمزيد من اختبار mRBP ، قم بتنقية الببتيدات من هلام صفحة 1D ثان كما هو موضح في بروتوكول النص. يمكن الآن تحليل هذه الببتيدات المنقاة عن طريق كروماتوغرافيا السائل العكسي النانوي ، وقياس الطيف الكتلي ، والبروتينات النوعية والكمية. بعد التقاط حبة oligo-d (T) ، أظهر qRT-PCR مستويات أعلى بكثير من mRNA المرجعي poly ubiquitin 10 مقابل 18S rRNA.

نظرا لأن حبات oligo-d (T) ترتبط فقط بالحمض النووي الريبي ذو الذيل poly-A ، فهذا يشير إلى أن mRNA يتم إثرائها في مادة المزيع. يتم تقييم التقاط mRBP بواسطة حبات oligo-d (T) بواسطة جل صفحة SDS ملطخ بالفضة. يظهر الجل كمية بروتين أعلى بكثير في عينة CL المتشابكة بالأشعة فوق البنفسجية مقابل العينة غير المتشابكة غير CL.

يمكن أن تؤثر مدة الأشعة فوق البنفسجية على كفاءة التشابك. يؤكد جل صفحة SDS الملون بالفضة أن دقيقة أو ثلاث دقائق من الأشعة فوق البنفسجية هي الحالة المثلى ، مع أقوى شدة النطاق. تم تحديد ما مجموعه 325 بروتينا عن طريق تحليل البروتينات الكمي.

كان 225 من هذه البروتينات أقل من مستوى الأهمية بسبب انخفاض وفرة الببتيدات الموجودة لكل بروتين ، مع تباين كبير في شدة الببتيد. ومع ذلك ، نظرا لأنه تم اكتشافها جميعا نوعيا فقط في عينات CL ، فقد اعتبرت جميعها نتائج إيجابية. تم تصنيف هذه البروتينات البالغ عددها 325 إلى ثلاث فئات ، البروتينات الريبوزومية ، و RBP الرئيسية ، و RBP المرشحة.

يفتقر RBP المرشح إلى مجالات ربط الحمض النووي الريبي التقليدية ولم يتم التحقق من صحة معظم أدوارهم ، مما يشير إلى وظائف جديدة محتملة في تنظيم الحمض النووي الريبي. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أسبوع واحد إذا تم إجراؤها بشكل مناسب. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال مسارات التنظيم الجزيئي في النباتات لاستكشاف البروتيوم المرتبط بالحمض النووي الريبي المرسال على مستوى الجينوم في خلايا وأنسجة ثنائيات الفلقة والأحيادية.