A طريقة الترشيح القائم على إعداد نوى عالية الجودة من عبر ربط العضلات والهيكل العظمي للكروماتين مناعي
يوليو 6, 2017
نقدم بروتوكول القائمة على الترشيح لعزل نوى ذات جودة عالية من عبر ربط الماوس العضلات والهيكل العظمي حيث أزلنا الحاجة لتنبيذ فائق، مما يجعلها قابلة للتطبيق بسهولة. وتبين لنا أن الكروماتين أعدت من نوى مناسبة للكروماتين مناعي ودراسات تسلسل مناعي لونين المرجح.
الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو السماح بإعداد نوى عالية الجودة من العضلات الهيكلية المتشابكة والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لدراسات الترسيب المناعي للكروماتين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العضلات والساعة البيولوجية مثل الدراسات الجينومية باستخدام أنسجة وخلايا العضلات في سياق الساعة البيولوجية أو سياق آخر حساس للوقت. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالربط المتبادل الفوري للعينات ويمكن إجراء الإجراء القائم على الترشيح بشكل موثوق لعزل النوى عالية الجودة مع الحد الأدنى من تلوث اللييفات العضلية.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للعضلات الهيكلية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل القلب والعضلات الملساء. قم بوزن وفرم عضلات الهيكل العظمي للطرف الخلفي المعزولة من ستة فئران سوداء C57 يبلغ من العمر 20 أسبوعا تقريبا في محلول ملحي مخمول بالفوسفات المثلج كما هو موضح سابقا. ضع أنسجة العضلات الهيكلية المفرومة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 مل من PBS على الجليد.
ثم قم بالطرد المركزي للعينة عند 300 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة المطفية PBS بعناية عن طريق الشفط. تقدير حجم الحبيبات في كل 50 أنبوب مليلتر باستخدام أنابيب مرجعية مع واحد, اثنان, ثلاثة, وأربعة ملليلتر من الماء.
أضف سبعة أحجام من الثلج البارد 1٪ الفورمالديهايد و PBS وقم بتجانس العينات على الجليد باستخدام مجانس أنسجة المسبار. بعد ذلك ، قم بربط العينة عن طريق احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بإخماد تفاعل الربط المتقاطع من خلال إضافة جلايسين مولاري واحد إلى تركيز نهائي قدره 0.125 مولار متبوعا بحضانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد الطرد المركزي للعينة عند 3 ، 000 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط. اشطف الحبيبات عن طريق تعليقها في 10 مل من القاعدة الباردة المثلجة التي تحتوي على مثبطات البروتياز المضافة حديثا. الطرد المركزي العينة مرة أخرى وإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الشفط.
ثم أعد تعليق الحبيبات في ستة ملليلتر من محلول التحلل الذي يحتوي على مثبطات البروتياز المضافة حديثا. انقل العينة إلى خالط Dounce المبرد مسبقا سعة 15 مليلتر واحتضنه لمدة 10 دقائق على الثلج. قم بتجانس كل عينة على الجليد ب 15 ضربة بطيئة باستخدام مدقة فضفاضة متبوعة ب 15 ضربة بمدقة ضيقة لتحرير النوى.
خطوات الترشيح التالية هي مفتاح عزل النوى عالية الجودة. قم بتصفية الجانس من خلال مصفاة خلية واشطفها بأربعة ملليلتر من محلول التحلل. ثم الطرد المركزي للعينات عند 1,000 مرة غرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من القاعدة المثلجة وقم بقطرها 10 مرات بمدقة محكمة لتحرير النوى. ثم قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية واشطف الأنبوب بملليلترين من المخزن المؤقت الأساسي وقم بالتصفية مرة أخرى. كرر الترشيح باستخدام مصافي الخلايا ذات حجم المسام المنخفض تدريجيا.
أخيرا ، جهاز الطرد المركزي عند 1 ، 000 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الأساسي قبل الطرد المركزي مرة أخرى. تخلص من المادة الطافية وقم بتخزين الحبيبات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
قم بإذابة العينات في 500 ميكرولتر من محلول تحلل SDS وإعادة تعليقها باستخدام ماصة لطيفة. انقل معلق الحمض النووي النوى إلى قارورة زجاجية على الجليد. يعد اختيار منصة الصوتنة المناسبة والحالة أمرا بالغ الأهمية لإعداد الكروماتين من النوى المعزولة.
قم بتشغيل الصوتنة مع رشقات نارية مركزة من الطاقة الصوتية بالموجات فوق الصوتية من محول طاقة على شكل قرص باستخدام الإعدادات الموضحة في بروتوكول النص. نقل الكروماتين صوتنة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم جهاز الطرد المركزي عند 12 ، 000 مرة جم لمدة 15 دقيقة ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.
بعد ذلك ، قم بنقل 50 ميكرولترا من العينة الصوتية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر للربط المتقاطع العكسي بين عشية وضحاها عند 65 درجة مئوية. يتم وصف حصاد عينات الحمض النووي في القسم التالي. بعد تقييم صوتنة والكمية كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بنقل الكروماتين المذاب إلى ما يقرب من 100 إلى 120 ميكروغرام لكل أنبوب.
ثم قم بتخفيف الكروماتين من واحد إلى 10 باستخدام المخزن المؤقت للترسيب المناعي. بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولترا من ملاط 50٪ من البروتين المحظور مسبقا BSA HE agarose أو حبات IgY واحتضنها على دوار لمدة ثلاث ساعات عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي للعينة عند 1 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق ، انقل المادة الطافية بعناية إلى أنابيب جديدة.
ثم أضف الأجسام المضادة بميكروغرام واحد من الجسم المضاد لكل 25 إلى 100 ميكروغرام من الحمض النووي للكروماتين. قم بالتدوير برفق طوال الليل عند أربع درجات مئوية وحوالي 15 دورة في الدقيقة. ثم أضف 10 ميكرولترات من البروتين المحظور مسبقا من BSA أو حبات HE agarose أو IgY واخلطها.
قم بتدوير تعليق الخرزة في الغرفة الباردة لمدة ساعتين. بعد ذلك ، اغسل الخرزات باستخدام المخزن المؤقت RIPA متبوعا بمخزن مؤقت عالي الملح ، ومخزن كلوريد الليثيوم ، و Tris EDTA كما هو مفصل في بروتوكول النص. بعد الغسيل ، قم بمسح الحمض النووي من الخرزات عن طريق الطرد المركزي أولا عند 1 ، 000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة وإزالة المادة الطافية بعناية.
أعد تعليق الخرزات بسعة 50 ميكرولتر من محلول الشطف. ثم احتضن لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية. بعد الحضانة ، جهاز الطرد المركزي عند 12 ، 000 مرة جم لمدة خمس دقائق.
قم بإزالة المادة الطافية وأضف 50 ميكرولترا أخرى من محلول الشطف قبل الطرد المركزي مرة أخرى عند 12،000 مرة جم لمدة خمس دقائق. سيكون حجم الشطف النهائي 100 ميكرولتر. لعكس الارتباط المتقاطع وإجراء شطف الحمض النووي ، قم أولا باحتضان الكروماتين الملطوع طوال الليل عند 65 درجة مئوية.
ثم أضف ميكرولتر واحد من RNase A قبل الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، احتضن بثمانية ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل مليلتر بروتياز K لمدة 30 دقيقة عند 55 درجة مئوية. احصد الحمض النووي باستخدام مجموعة تنظيف PCR بحجم شطف يبلغ 50 ميكرولتر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
أخيرا ، قم بتحليل ملفات التعريف بواسطة QPCR في الوقت الفعلي كما هو موضح سابقا. الترشيح المتسلسل أزال بقايا الأنسجة بشكل فعال. يتم عرض الصور التمثيلية للعينات بعد الترشيح الأولي وبعد الترشيح التسلسلي هنا للمقارنة.
يتمالكشف عن تمزيق الكروماتين التدريجي من خلال 10 دورات من الصوتنة من خلال تشغيل هلام الاغاروز. 10 دورات من صوتنة مع الكروماتين المهضوم نتج عن الحمض النووي لحوالي 500 زوج قاعدة. هنا ، يتم عرض نتائج QPCR التمثيلية للذكور B chIP واحد مع عينات من عضلات الهيكل العظمي للفأر التي تم جمعها في ZT6 و ZT18.
كشف تحليل عناصر مواقع Dbp على جين Dbp أنه بما يتفق مع النتائج السابقة ، فإن ذروة الربط عند حوالي ZT6. بمجرد إتقانها ، يمكن تحضير النوى في غضون خمس إلى ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الطرق القائمة على الترشيح لتنقية النوى عالية الجودة والحمض النووي للكروماتين من الأنسجة العضلية المتشابكة.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بالعينات على الجليد أو في غرفة باردة وحفظ عينات للفحص المجهري قبل وبعد خطوات الترشيح. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العضلات وعلم الجينوم لاستكشاف ديناميكيات الساعة البيولوجية أو الحساسة للوقت لتفاعل الكروماتين والبروتين في أنسجة العضلات المختلفة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل chIP من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل البحث عن أنماط ربط عامل النسخ في أنسجة العضلات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا المقال بروتوكولًا قائمًا على الترشيح لفصل نوى عالية الجودة من عضلات الهيكل العظمي للفئران المرتبطة ترابطًا متقاطعًا. تقضي الطريقة على الحاجة إلى الطرد المركزي الفائق، مما يجعلها أكثر سهولة للباحثين. الكروماتين المحضر مناسب لدراسات ترسيب الكروماتين المناعي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- فيزيولوجيا العضلات
الخلفية
- أهمية النوى عالية الجودة في الدراسات الجينومية.
- التطبيق في الأبحاث المتعلقة بالدورة اليومية والحساسة للوقت.
- الإمكانية للحصول على رؤى حول أنظمة العضلات الهيكلية، القلبية، والناعمة.
- التقليل من التلوث بالميوفيفيلات في العينات.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لعزل النوى من العضلات الهيكلية.
- تسهيل دراسات ترسيب الكروماتين المناعي.
- تعزيز فهم الأنسجة العضلية في سياقات بيولوجية مختلفة.
الطرق المستخدمة
- عضلات الساق الخلفية المفرومة من الفئران الذكرية C57 black six.
- استخدام محلول ملحي فوسفات بارد مثل الثلج لحفظ الأنسجة.
- تنفيذ إجراء قائم على الترشيح لعزل النوى.
- الهدف هو تقليل التلوث إلى الحد الأدنى خلال العملية.
النتائج الرئيسية
- نجح في عزل نوى عالية الجودة من العضلات الهيكلية.
- الكروماتين المحضر مناسب لدراسات ترسيب الكروماتين المناعي.
- تظهر الطريقة إمكانات لاستخدامها على نطاق أوسع في أبحاث العضلات.
- تظهر الموثوقية وسهولة الاستخدام مقارنة بالطرق التقليدية.
الاستنتاجات
- البروتوكول القائم على الترشيح فعال لعزل النوى.
- يوفر أداة قيّمة للباحثين في بيولوجيا العضلات.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه الطريقة لأنواع مختلفة من العضلات.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Isolation of high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle is a critical bottleneck for chromatin immunoprecipitation (ChIP) and genomic studies in muscle biology. This filtration-based protocol enables reproducible preparation of nuclei with minimal myofibril contamination, supporting robust interrogation of protein-DNA interactions in time-sensitive and circadian contexts. The method enhances predictive confidence and workflow continuity for discovery-stage and translational muscle research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of chromatin-protein interactions in muscle tissue under physiological conditions.
- Supports mechanistic de-risking by preserving native DNA-protein complexes during nuclei isolation.
- Facilitates functional target validation for transcription factors and epigenetic regulators in muscle systems.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-quality nuclei preparations for downstream ChIP and sequencing assays.
- Improves assay reproducibility by minimizing myofibril contamination and sample variability.
- Enables quantitative evaluation of protein-DNA binding dynamics across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by allowing analysis of circadian and time-sensitive chromatin states in muscle tissue.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation for muscle-targeted therapeutics.
- Facilitates integration with next-generation sequencing for biomarker and pathway discovery.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling reliable chromatin analysis from early mechanistic studies to translational research in muscle biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of transcription factor binding and chromatin state in muscle tissue.
- Screening: Delivers reproducible nuclei preparations for ChIP and sequencing assay readiness.
- Analytics: Provides quantitative outputs via qPCR and sequencing for comparative analysis of binding events.
- Translational Research: Enables time-sensitive studies relevant to circadian biology and muscle disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable nuclei isolation workflow for multiple muscle tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in chromatin-protein interaction studies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes nuclei isolation, improving reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making by providing robust, high-quality input for downstream genomic assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of muscle-targeted discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, cross-linking, and filtration-based nuclei isolation.
- Needs access to sonication platforms, filtration devices, and qPCR or sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility across studies.
- Adaptable to other muscle types, including cardiac and smooth muscle, with protocol optimization.
- Sample integrity and temperature control are critical for consistent nuclei quality.
