مضبوطات اليكتروكونفولسيفي في الفئران وتجزئة لهذه هيبوكامبي دراسة التغيرات المستحثة بالضبط في البروتينات بوستسينابتيك الكثافة

الهدف العام من تحريض النوبات الكهربائية والتجزئة اللاحقة على نطاق صغير للحصين هو تحفيز نشاط النوبة العالمي في دماغ الفئران ، وفحص نشاط النوبات الناجم عن التغيرات في البروتينات في كثافة ما بعد المشبكي للحصين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في العملية العصبية للفيلم ، مثل البروتينات السريعة التي يتم تنظيمها في مناطق معينة من الدماغ عند النوبة ، وما إذا كان هذا التنظيم يمكن أن يساهم في المرونة العصبية. الميزة الرئيسية لبروتوكول تحريض النوبات بالصدمات الكهربائية هي أنه يمكننا إحداث ارتفاع lo-bal لنشاط الدماغ دون موت الخلايا العصبية.

سأعرض الإجراء أنا وهان جيل جيونغ من مختبر الدكتور هي جونغ تشونغ. لبدء هذا الإجراء ، ضع فأرا ذكرا في قفص نظيف وفارغ بغطاء. دع الجرذ يعتاد لمدة 30 دقيقة ، ثم اضبط مولد النبض لحث ECS.

قم بإعداد مولد النبض عن طريق الضغط على زر إعادة الضبط وتأكد من إضاءة زر الاستعداد. تأكد من عدم توصيل مشابك الأذن بمولد النبض. بعد ذلك ، اضغط على زر الصدمة لبضع ثوان ، ثم قم بتوصيل مشابك الأذن بمولد النبض.

في هذه الخطوة ، بلل مشابك الأذن بمحلول ملحي معقم وتأكد من تشبعها. بعد ذلك ، بلل آذان الفئران بمحلول ملحي معقم عن طريق لفها بشاش مبلل بالملح. بمجرد أن تصبح مبللة ، قم بإزالة الشاش.

قم بتوصيل المشابك بالأذنين بمشبك واحد لكل أذن وضعها خارج شريط الغضروف الرئيسي. اضغط على زر الصدمة لبضع ثوان وراقب النوبة. بالنسبة للزائفة ، لا توجد سيطرة على النوبات ، تعامل مع الفئران بشكل متماثل ، لكن لا تقدم التيار.

عندما يبدأ الاستنساخ ، افصل مشابك الأذن وسجل سلوك النوبة وفقا لمقياس راسين المنقح من واحد إلى خمسة. وهذا يشمل التربية باستخدام أربعة أطراف في المرحلة الرابعة ، والتربية والسقوط باستخدام استنساخ أربعة أطراف في المرحلة الخامسة. يجب أن تستمر النوبة حوالي 10 ثوان.

سجل مدة النوبة باستخدام مؤقت. بعد إنهاء النوبة ، أعد الجرذ إلى قفص منزله. راقب الجرذ لمدة خمس دقائق أخرى للتأكد من تعافيه من النوبات.

احتفظ بها منفردة في القفص ، وأعد القفص إلى غرفة الإنعاش. في هذا الإجراء ، ضع حبتين من الحصين من فأر واحد على طبق زراعة الأنسجة بحجم 30 ميلومتر وافرمهما إلى قطع صغيرة باستخدام المقص. بعد ذلك ، انقل الحصين المفروم إلى الخالط الزجاجي اليدوي وأضف ملليلترا واحدا من محلول التجانس البارد المثلج.

بعد ذلك ، أدخل قطعة مستديرة في الخالط الزجاجي. أثناء وجود الخالط الزجاجي على الجليد ، قم بتمرير الخالط برفق وثبات لأعلى ولأسفل على pecil، من 10 إلى 15 مرة لمدة دقيقة واحدة حتى تختفي قطع صغيرة من أنسجة الحصين. بعد ذلك ، قم بنقل التجانس إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.7 ميلومتر باستخدام ماصة ميلومتر واحد وجهاز الطرد المركزي homogenote عند 800 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لفصل المادة الطافية بعد النووية عن الحبيبات التي تحتوي على أنسجة نوى غير قابلة للذوبان.

بعد ذلك ، قم بنقل 50 ميكرولتر و 950 ميكرولتر من جزء S1 إلى أنبوبين منفصلين جديدين للطرد المركزي 1.7 مليلتر وقم بتخزين هذه الأنابيب على الجليد. أيضا, احفظ حبيبات الكسر P1 على الجليد. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لجزء S1 سعة 950 ميكرولتر لمدة 10 دقائق عند 13 ، 800 مرة جروا وأربع درجات مئوية لفصل المادة الطافية المخصب بالبروتينات القابلة للذوبان العصارية الخلوية والحبيبات المخصبة بالبروتينات المرتبطة بالغشاء ، بما في ذلك البروتينات المتشابكة.

انقل جزء S2 إلى جهاز طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.7 مل وقم بتخزينه على الجليد. بعد ذلك, أعد تعليق حبيبات الكسر P2 في 498 ميكرولتر من الماء النقي المثلج. أضف ميكرولترين من كتلة العجان المولية الواحدة لتحقيق تركيز نهائي يبلغ أربعة مللي مولار.

احتضان التعليق عند أربع درجات مئوية مع التحريض لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، قم بتخزين الجزء P2 المعلق على الثلج. في هذه الخطوة ، قم بالطرد المركزي لجزء P2 لمدة 20 دقيقة عند 25،000 مرة G وأربع درجات مئوية لفصل المادة الطافية المحللة والحبيبات المحللة.

انقل جزء LS2 إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.7 مليلتر وقم بتخزينه على الثلج. بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات LP1 في 250 ميكرولتر عند 50 مللي مولار ، ممزوجة ب 250 ميكرولتر من المنظفات بنسبة واحد بالمائة ، و 1 × PBS. احتضان التعليق عند أربع درجات مئوية مع تحريك لطيف لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لحبيبات LP1 المعلقة لمدة 3 ساعات عند 25 ، 000 مرة من الدرجة المئوية وأربع درجات مئوية لفصل المادة الطافية للكسر غير PSD عن حبيبات كسر PSD. قم بإزالة المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مليلتر وأعد تعليق حبيبات PSD في 100 ميكرولتر من 50 ملليمول. في هذا الشكل ، تظهر البقع الغربية التمثيلية التعبير البروتيني للوحدة الفرعية المستقبلة NMDA GluN2B ، ومستقبلات أمبا ، و GluA2 ، و STEP 61 في كسور S2 و P2 و PSD من الحصين من الوسام ، والفئران التي لا تتعرض للنوبات ، والجرذان التي تلقت ECS حادا.

إثراء البروتين السيتوبلازمي القابل للذوبان ألفا توبولين في جزء S2. Synaptophysin هو بروتين حويصلة قبل المشبكي ويتم إثرائه في جزء الغشاء الخام P2 ولكن ليس في جزء PSD ، بينما يتم إثراء PSD-95 في كل من كسور P2 و PSD. كما هو موضح هنا ، هو القياس الكمي ل GluN2B و GluA2 في كسور P2 و PSD في ثلاث و 24 ساعة بعد ECS الحاد.

تطبيع تعبير GluN2B و GluA2 في الجزء P2 إلى ألفا توبولين في جزء S2. في GluN2B و GluA2 التعبير في جزء PSD ، تم تطبيعه إلى PSD 95 في جزء PSD. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون خمس إلى ست ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء الكتلة التلقائية مثل الكتلة ، وقياس الطيف ، بناء على مزيج البروتين من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، ما هي البروتينات المشبكية الأخرى التي يتم تغييرها بواسطة ECS. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأمراض العصبية لاستكشاف الآلية الأساسية للخلل الوظيفي المشبكي من أجل فعل القانون ، والمحركات المتحولة للأمراض العصبية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز ECS في القانون ، وإجراء التجانس وتجزئة PSD من الحصين وفحص التغيرات في البروتينات المشبكية بعد ECS.