يوليو 31, 2017
وقد تم تطوير هذا البروتوكول لتحديد كميا مكونات المكروية الورم في ريسيكلتيونس المريض ورم أروميوجيستوك باستخدام الكيمياء المناعية و إيماجيج.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد مكونات البيئة المكروية للورم كمي في استئصال مرضى الورم الأرومي الدبقي باستخدام الكيمياء المناعية الملونة والصورة J. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيئة المكروية للورم ، مثل كيف تبدو هذه المكونات في عينات المرضى وكيف يمكننا تحديد نسب الخلايا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة التحليل في عينات المرضى. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو توضيح البيئة المكروية المعقدة للورم الأرومي الدبقي غير المتميزة.
بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن توقيت تطور اللونات يحتاج إلى مراقبة عن كثب لمنع الإفراط في النمو وتشبع الأنسجة. ابدأ البروتوكول بإجراء عمليات الغسيل المحددة في بروتوكول النص المصاحب. قم بتخفيف محلول كشف المستضد عالي الأس الهيدروجيني القائم على tris والماء المقطر باستخدام توصيات الشركات المصنعة.
انتقل إلى استرجاع المستضد بوساطة الحرارة عن طريق إضافة محلول كشف القناع المخفف إلى وعاء غير محكم الغلق يمكن تسخينه في الميكروويف. ضع الشرائح في الوعاء. ثم ضع الوعاء في الميكروويف.
بعد ذلك ، اغلي الوعاء لمدة 20 دقيقة بقوة عالية. راقب مستويات السائل للتبخر وقم بتجديد الوعاء بالماء المقطر حسب الضرورة. اترك العينات لتبرد في المحلول لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
حدد عينة الأنسجة باستخدام مسعور لتقليل حجم الكواشف اللازمة لتغطية العينة. ثم ، قم بوضع ما يكفي من محلول النفاذية ، من 100 إلى 200 ميكرولتر لتغطية عينة الأنسجة. قم بإزالة المحلول والتخلص منه وقم بتغطية عينة الأنسجة بمحلول النفاذية مرة أخرى.
احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة بمحلول مانع لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم باحتضان العينات طوال الليل في أربع درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحظر. في اليوم التالي ، اكتشف الأجسام المضادة الأولية باستخدام كاشف بوليمر بيروكسيداز الفجل المقابل للحيوان المضيف للجسم المضاد الأساسي.
ضع محلول نفاذية كاف لتغطية عينة الأنسجة واحتضان العينة لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المحلول والتخلص منه وقم بتغطية عينة الأنسجة في محلول النفاذية مرة أخرى لمدة خمس دقائق. احتضان الشرائح في 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين و IX TBS لمدة 15 دقيقة.
قم بتطوير العينات باستخدام ركيزة بيروكسيداز ديامينوبنزيدين أو ربت لمدة دقيقتين إلى 10 دقائق حتى يتم تحقيق شدة البقعة المطلوبة. قم بتلطيخ العينات لتحديد نوى الخلية ، مثل الهيماتوكسيلين باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. تجفيف العينات بنسبة 100٪ من الإيثانول والزيلين.
أخيرا ، قم بتركيب العينات بشكل دائم باستخدام وسائط التثبيت. تم تحديد منطقتين مهمتين في عمليات استئصال الورم لدينا ، وهما الورم الأساسي السائب والمناطق المجاورة ، المكونة بشكل أساسي من أنسجة سليمة ذات خلايا سرطانية غازية منتشرة من قبل أخصائي أمراض الأعصاب المتعاون في عينات المرضى الملطخة بالهيماتوكسيلين واليوزين. حددت الكيمياء المناعية الكروموجينيك تلطيخا إيجابيا للخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية قليلة التغصن داخل كل عينة من عينة المريض.
أجرينا تلطيخا بدون جسم مضاد أولي للتحكم السلبي. أوصت الشركة المصنعة بمزيد من التخفيفات قبل الاستقرار على التخفيف من واحد إلى 200 بسبب التلوين الإيجابي الأمثل لجسم الخلية والعملية مع تقليل الخلفية للجسم المضاد ALDH 1l1. باستخدام الصورة J ، تم قياس النسبة المئوية للتغطية المئوية لتلوين الخلايا قليلة التغصن الإيجابية OSP-1 لمقارنة الاختلافات في مناطق اهتمامنا في النهاية.
بمجرد تطبيق العتبة المناسبة على الصورة ، يمكن قياس النسبة المئوية للتغطية من العتبة ومقارنتها لعدة مرضى. تمت مقارنة خمس مناطق متجاورة وسائبة من عينات مرضى الورم الأرومي الدبقي أو GBM ، جنبا إلى جنب مع أنسجة المخ السليمة لتغطية البروتين النوعي لقليل التغصن أو OSP1 في المائة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية التلوين في أربع ساعات في اليوم الأول وساعتين في اليوم الثاني إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر مراقبة شدة تلطيخ الأنسجة وترطيبها عن كثب.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
يصف هذا البروتوكول طريقة لتحديد مكونات بيئة الورم الدقيقة في استئصالات مرضى الورم الأرومي الدبقي باستخدام المناعية النسيجية الكروماتوجينية وبرنامج ImageJ. تهدف هذه التقنية إلى توفير رؤى حول بيئة الورم الأرومي الدبقي المعقدة.
Quantitative analysis of the tumor microenvironment in patient-derived glioblastoma samples enables mechanistic de-risking of glial cell targets in neuro-oncology drug discovery. By providing reproducible, region-specific measurements of astrocytes, microglia, and oligodendrocytes, this method supports target validation and phenotypic screening in disease-relevant systems. It enhances predictive confidence in preclinical models by linking microenvironment composition to therapeutic response and resistance mechanisms.
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for neuro-oncology programs focused on microenvironment modulation.