الأفقي جل الكهربائي للكشف عن تعزيز المجمعات البروتين رنا

يتمثل إجمالي هذا البروتوكول في تحليل تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام الأصلي الأفقي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الكيمياء الحيوية للحمض النووي الريبي ، مثل تحديد خصائص تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي المحددة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بمراقبة التكوين المعقد عدة مرات أثناء الرحلان الكهربائي.

بالنسبة لجهاز الجل الأفقي ، استخدم صندوقا جليا بصينية صب مقاس 27 سم × 21 سم وسعة 24 مشطا بئر. يوفر هذا الإعداد ما مجموعه 48 عينة يمكن تحليلها في وقت واحد. قم بإعداد لترين من 1x TBE تشغيل المخزن المؤقت عن طريق تخفيف 400 مل من 5x TBE مع 1 ، 600 مل من الماء والخلط.

ضع المخزن المؤقت TBE في الغرفة الباردة ليبرد. قم بإعداد الكواشف التالية باتباع الإجراءات القياسية ، أفضل 40٪ أكريلاميد 19: 1 ، 5x TBE ، temed و 10٪ أمونيوم لكل كبريتات. لصنع هلام أكريلاميد أصلي بنسبة 10٪ ، أضف ما يلي إلى قارورة سعة 500 مل: 80 مل من 5x TBE ، 100 مل من 40٪ أكريلاميد وماء إلى حجم نهائي يبلغ 400 ملليلتر.

أضف أربعة ملليلتر من 10٪ أمونيوم لكل كبريتات و 400 ميكرولتر من المرطب واخلطهم جيدا. صب المزيج في صينية الصب الأفقية واترك الجل يتبلمر في غطاء الدخان لمدة 30 دقيقة. يبلغ سمك الجل المبلمر حوالي سنتيمترين وستبقى طبقة رقيقة من السائل فوق الجل.

ضع الجل في صندوق الجل وخذه إلى الغرفة الباردة. بعد ذلك ، اسكب السائل واشطفه بمحلول تشغيلي. قم بإزالة الأمشاط بعناية ، وأضف لترين من المخزن المؤقت البارد إلى صندوق الجل ثم استخدم حقنة لشطف الآبار باستخدام عازلة التشغيل.

قم بتشغيل الجل مسبقا عند 120 فولت لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية في غرفة باردة. أثناء تشغيل الجل مسبقا ، قم بإعداد تفاعلات الربط. أضف مكونات تفاعل الربط التالية إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق خال من الحمض النووي الريبي بهذا الترتيب: خمسة ميكرولتر من 10 ملليمولار BSA ، وخمسة ميكرولتر من 20 ملليمولار DTT ، وخمسة ميكرولترات من 10 ملليمولات خميرة tRNAs ، و 10 ميكرولترات من 5x مخزن مؤقت ملزم ، وبروتين ثنائي الأبعاد إلى تركيز نهائي يبلغ 250 نانومولار في 50 ميكرولترا ، والمياه المعالجة DEPC إلى الحجم النهائي البالغ 45 ميكرولتر وخمسة ميكرولترات من ركيزة الحمض النووي الريبي المسمى بالفلورسنت.

أغلق الأنابيب ونفض الغبار برفق للخلط ، وقم بالطرد المركزي للأنابيب لفترة وجيزة واحتضانها في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عند اكتمال تفاعلات الربط ، أضف 15 ميكرولترا من 50٪ من الجلسرين إلى كل تفاعل واخلطه برفق. قم بتحميل 30 ميكرولترا بعناية من كل تفاعل في آبار الجل ، وتختلف كمية العينة التي يمكن تحميلها في بئر واحد اعتمادا على سمك الجل وحجم الآبار.

مصدر الطاقة لجهاز الجل ، قم بتشغيل الطاقة ، وضبط الجهد على 120 فولت وتشغيل الجل في أربع درجات مئوية. لمنع إتلاف أو تبييض الحمض النووي الريبي المسمى بالفلورسنت ، قم بإجراء الرحلان الكهربائي في الظلام. تختلف أوقات الرحلان الكهربائي اعتمادا على تفاصيل مركب بروتين الحمض النووي الريبي الذي يتم تحليله.

تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لتحليل مقايسة تحول الحركة الكهربية الأفقية في أنه يمكن إيقاف الرحلان الكهربائي في صورة الهلام قبل الانتهاء من التشغيل. إجراء التحليل باستخدام أي أداة مصممة للكشف عن ركائز الفلورسنت التصويرية. اضبط إعدادات التصوير، بالنسبة للروابط ذات العلامات الفلورية، استخدم الإعدادات التالية.

الطول الموجي للفلورسين 473 نانومتر ، جهد مضاعف ضوئي 750 فولت وحجم بكسل 100 ميكرومتر. امسح الجل ضوئيا لالتقاط الصورة. بعد التصوير ، يمكن إعادة الجل إلى الجهاز ويمكن الاستمرار في الرحلان الكهربائي لفترات أطول.

تم تحليل ارتباط بروتين xenopus bicaudal-C أو Bicc1 ب Cripto1 mRNA المسمى بالفلورسنت والذي يحتوي على موقع ربط Bicc1 ، عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام الأصلي الرأسي والأفقي ، كعنصر تحكم سلبي ، تم خلط Bicc1 مع RNA المسمى بالفلورسنت مشتق من CyclinB1 mRNA. كان من الواضح بسهولة باستخدام أي من الطريقتين ، أن Bicc1 يرتبط ب Cripto1 RNA ويشكل مركبا معينا. ومع ذلك ، كانت مجمعات Bicc1 و Cripto1 أكثر تميزا بشكل ملحوظ عند تحليلها باستخدام الهلام الأفقي ، مما يسهل اكتشافها ويسمح بتمييز مجمعات الحمض النووي الريبي البروتيني عن الحمض النووي الريبي غير المرتبط.

بعد التصوير ، تم إرجاع الجل إلى جهاز الهلام ، والرحلان الكهربائي لمدة ثلاث ساعات ونصف إضافية ، وإعادة تصويره. كما هو موضح هنا ، هاجرت المجمعات إلى أبعد من ذلك ولا يزال من الممكن اكتشافها بسهولة ، مما يشير إلى استقرارها. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أربع إلى خمس ساعات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام الأصلي الأفقي.