مرحلة السلوك من حويصلات مشحونة بظروف الحل المتماثلة وغير المتماثلة رصدها بالفحص المجهري الأسفار
أكتوبر 24, 2017
كثيرا ما تهمل تجارب على مرحلة فصل أونيلاميلار العملاقة حويصلات (جوفس) الظروف الفسيولوجية الحل. ويعرض هذا العمل النهج لدراسة تأثير الملوحة العالية المخزن المؤقت على المرحلة سائل فصل في مشحونة جوفس متعددة المكونات كدالة عبر غشاء حل التباين ودرجة الحرارة.
الهدف العام لهذا البروتوكول هو التقييم الكمي لتأثير بيئات الملوحة العالية وقياس محلول الغشاء الموجود في الظروف الفسيولوجية على حالات طور الغشاء. تختلف المحاليل داخل الخلية والخلايا الخارجية اختلافا كبيرا. تساعد أساليبنا في فهم تأثير قياس المحلول على خصائص الغشاء وسلوك الطور.
الميزة الرئيسية لنهجنا هي أنه يمكن تحضير الحويصلات في ظروف عازلة فسيولوجية ويمكن استخدام جهاز الموائع الدقيقة لإنشاء ظروف عازلة غير متماثلة. لبدء الإجراء ، قم بتخشين جانب واحد من لوحة PTFE بورق صنفرة ناعم. اغسل اللوحة ، قارورة زجاجية سعة 15 مليلتر ، ووعاء زجاجي قابل للغلق بمنظف تجاري لغسل الأطباق والإيثانول والكلوروفورم.
استخدم حقنة زجاجية سعة 25 ميكرولترا لإيداع 10 إلى 15 ميكرولترا من مخزون الدهون في الكلوروفورم على الجانب الخشن من لوحة PTFE النظيفة والجافة. انشر مخزون الدهون بإبرة المحقنة لإنشاء طبقة دهنية موحدة. استخدم الملقط لنقل اللوحة إلى قارورة سعة 15 مل.
سخني الطبق على حرارة 60 درجة مئوية وجففيه لمدة ساعتين لتبخر المذيب. ثم أضف الماء منزوع الأيونات إلى وعاء زجاجي على ارتفاع حوالي سنتيمتر واحد. ضع القارورة مع اللوحة في الحاوية ، مع التأكد من بقائها مستقرة ومنتصبة وإغلاق الحاوية.
اترك الطبقة الدهنية الثنائية تنتفخ مسبقا عند 60 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. ثم أخرج القارورة من الحاوية. ارسم خمسة ملليلتر من محلول التورم في حقنة بلاستيكية وقم بتوصيل مرشح 0.45 ميكرومتر بطرف المحقنة.
أضف محلول التورم المصفى إلى القارورة لترطيب طبقة الدهون. قم بتغطية القارورة وأغلق القارورة بغشاء البارافين البلاستيكي. قم بتخزين القارورة على حرارة 60 درجة مئوية طوال الليل للحصول على ركام GUV.
قم بتبريد الحويصلات إلى درجة حرارة الغرفة في غضون ساعة من إزالتها من الحرارة. اقطع طرف ماصة بلاستيكية دقيقة سعة 200 ميكرولتر ، بحيث يمكن سحب ركام GUV في الحافة. استخدم طرف الماصة المشذب لنقل الركام و 50 ميكرولترا من محلول التورم إلى قارورة نظيفة وجافة سعة ملليلترين.
أضف إلى القارورة 950 ميكرولتر من محلول التورم الطازج أو محلول متساوي التوتر لتحقيق ظروف محلول متماثل أو غير متماثل على التوالي. قم بضرب الخليط لأعلى ولأسفل ثم اقلب القارورة برفق عدة مرات لإعادة تعليق GUVs. لبدء التقييم ، ضع حصة من تعليق GUV في عازل سيليكون في شريحة مجهرية.
أغلق الغرفة بغطاء غطاء. اسمح للعينة بإعادة التوازن لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، ضع الشريحة على مرحلة العينة من المجهر الفلوري واحصل على صور لما لا يقل عن 30 GUVs لكل دفعة.
افحص الصور لتحديد حالات الطور لصور GUVs. ستكون GUVs في حالة الطور السائل الواحد كروية وناعمة مع ملصق فلوري موزع بشكل متجانس في جميع أنحاء الغشاء. ستكون GUVs في حالة سائل مرتبة ومضطربة من مرحلتين كروية مع ملصق فلوري مقسم إلى مجالات ذات حدود ناعمة داخل الغشاء.
تحقق من أن المجالات حرة في الانتشار على أسطح الحويصلة ويمكن أن تتحد سيتم تقريب GUVs في حالة الطور السائل الصلب ثنائي الطور أو ثلاثي الطور ببعض الحدود الزاوية. يجب ألا تعرض المجالات السائلة على خلفية صلبة انتشارا ، ولكن يجب أن تنتشر المجالات الصلبة بحرية على خلفية سائلة.
بمجرد تحديد حالة الطور لكل صورة GUV ، حدد حالة المرحلة السائدة للدفعة. كرر العملية مع عينات مستقلة إذا كانت حالة المرحلة السائدة أغلبية ضئيلة. قبل استخدام جهاز الموائع الدقيقة ، قم بإعداد ما لا يقل عن خمسة ملليلتر لكل من محاليل تورم السكروز والملح.
قم بتصفية كل محلول من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر. بعد ذلك، قم بقص أطراف الماصة البلاستيكية سعة 200 ميكرولتر وضع طرف ماصة في كل قناة من قنوات الجهاز. أضف إلى خزان الجهاز 100 ميكرولتر من محلول التورم الطازج المصفى من نفس النوع المستخدم في تحضير GUVs.
أضف خمسة ميكرولترات من محلول التورم إلى كل طرف ماصة. جهاز الطرد المركزي للجهاز عند 900 مرة G لمدة 10 دقائق لملء قنوات الجهاز. ثم املأ حقنة زجاجية سعة مليلتر واحد بنفس محلول التورم المصفى.
قم بتوصيل طول الأنبوب بالمحقنة. ادفع محلول التورم عبر الأنبوب حتى يتم الضغط على المكبس تماما ويمتلئ الأنبوب بالمحلول. بعد ذلك ، قم بتوصيل الأنبوب بقناة المخرج وقم بتركيب المحقنة على مضخة حقنة.
بعد ذلك ، قم بتوصيل وحدة التحكم في الضغط بمداخل قناة الموائع الدقيقة. تأكد من إغلاق الصمامات ثم اضبط الضغط على ثلاثة أشرطة. ضع جهاز الموائع الدقيقة على مرحلة العينة من المجهر متحد البؤر المقلوب.
استخدم ماصة لإزالة محلول التورم من خزان الجهاز حتى يتبقى 25 إلى 50 ميكرولترا فقط من المحلول. أضف 150 ميكرولترا من نظام التعليق GUV إلى الخزان واخلط التعليق مع سحب العينة اللطيف. قم بتشغيل مضخة الحقنة في وضع السحب بسرعة 10 ميكرولتر في الدقيقة لمدة 20 دقيقة أو حتى يتم شغل أكثر من 90٪ من مصائد الجهاز.
بعد ذلك ، افتح صمامات وحدة التحكم في الضغط لإغلاق الصمامات الحلقية في جهاز الموائع الدقيقة. أوقف مضخة الحقنة واترك الجهاز يجلس لمدة ساعة واحدة قبل الحصول على صور متحدة البؤر لمركبات GUV في الجهاز. بعد ذلك، استخدم ماصة لإزالة تعليق GUV من الخزان لتترك 25 إلى 50 ميكرولترا فقط.
أضف إلى الخزان 150 ميكرولترا من النوع الآخر من محلول التورم المصفى وقم بسحب الخليط برفق لأعلى ولأسفل. كرر هذه العملية خمس مرات على الأقل لاستبدال المحلول في الخزان بالكامل. قم بتشغيل مضخة الحقنة في وضع السحب بسرعة 10 ميكرولتر في الدقيقة لمدة 10 دقائق لاستبدال المحلول في القنوات الدقيقة.
ثم قلل معدل التدفق إلى ميكرولتر واحد في الدقيقة. أغلق صمامات وحدة التحكم في الضغط لمدة ثانيتين ثم افتح الصمامات وأوقف مضخة الحقنة. اسمح للجهاز بالجلوس لمدة ساعة واحدة قبل تسجيل الصور متحد البؤر.
لبدء تحضير غرفة التحكم في درجة الحرارة ، قم أولا بتوصيل تركيبات الأنابيب الشائكة بمجموعة تدفق حراري من الألومنيوم مع نوافذ غطاء بسمك ملليمترين. قم بتوصيل فاصل مطاطي بأحد أغطية الغطاء لتشكيل غرفة المراقبة. قم بتحميل 100 ميكرولتر من نظام التعليق GUV في غرفة المراقبة وأغلق الغرفة بغطاء غطاء.
اقلب التجميع ببطء. قم بتوصيل حجرة الألمنيوم بحمام مائي خارجي. قم بتركيب التجميع على مرحلة عينة المجهر.
اضبط الحمام المائي الخارجي على أدنى درجة حرارة مطلوبة واترك النظام يتوازن لمدة 10 إلى 15 دقيقة. احصل على صور لمركبات GUV وحدد حالات الطور في درجات حرارة مختلفة. تم تحضير GUVs من نسب متفاوتة من DOPG والبيض sphingomyelin والكوليسترول في محاليل السكروز أو الملح المتماثلة.
تم تحديد حالات المرحلة المهيمنة عن طريق الفحص المجهري الفلوري. ثم تم نقل التركيبات المختارة إلى ظروف غير متماثلة عن طريق التخفيف لتقييم ظروف الحل الفعالة على سلوك الطور. لمزيد من التحقيق في سلوك طور GUV في المحاليل غير المتماثلة ، تم احتجاز GUVs في جهاز ميكروفلويديك للسماح بالتبادل الكامل للمحلول الخارجي.
تم تقييم GUVs المحاصرة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر قبل وبعد التبادل السائل. تمت مراقبة جزء GUVs المتجانسة إلى المنفصلة عن الطور على نطاق من درجات الحرارة لتقييم درجة الحرارة الفعالة على سلوك طور GUV. لوحظ نمط سيني في البيانات ، والتي كانت بعد ذلك مناسبة لنموذج بولتزمان.
تم تحديد درجة الحرارة التي كان عندها جزء GUVs المفصولة عن الطور 0.5 من المنحنى المجهز. على الرغم من أن هذه الطرق يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لسلوك طور الغشاء ، إلا أنه يمكن أيضا استخدام التطبيقات لتجارب أخرى ، مثل دراسة التفاعلات بين الأغشية في الجزيئات الحيوية في الظروف الفسيولوجية.
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في تأثير ظروف المخزن المؤقت ذي الملوحة العالية على الفصل بين الطور السائل-السائل في الحويصلات الثنائية الطبقة العملاقة المتعددة المكونات المحملة بالشحنة (GUVs). تؤكد الأبحاث على أهمية عدم التماثل عبر الغشاء في حل المحلول ودرجة الحرارة في فهم خصائص الغشاء.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الفيزياء الحيوية
- بيولوجيا الغشاء
الخلفية
- الحويصلات الثنائية الطبقة العملاقة (GUVs) هي نظم نموذجية لدراسة ديناميكيات الغشاء.
- غالبًا ما تختلف الظروف الفسيولوجية بشكل كبير عن الإعدادات التجريبية.
- فهم سلوك الطور في الأغشية أمر بالغ الأهمية للحصول على رؤى حول العمليات الخلوية.
- يمكن أن تؤدي البيئات الملحية العالية إلى تغيير خصائص الغشاء وحالات الطور.
هدف الدراسة
- لتقييم الكمي لآثار الملوحة العالية وعدم التماثل عبر الغشاء في حالات الطور في الغشاء.
- لتطوير طرق لتحضير GUVs تحت ظروف المخزن المؤقت الفسيولوجية.
- لاستكشاف تأثير عدم التماثل في المحلول على خصائص الغشاء وسلوك الطور.
الطرق المستخدمة
- تحضير أغشية الدهون على ألواح PTFE متبوعًا بالترطيب لتشكيل GUVs.
- استخدام الأجهزة الدقيقة لإنشاء ظروف مخزن مؤقت غير متماثلة.
- المجهر الفلوري لتقييم حالات الطور في GUVs.
- تحليل كمي لحالات الطور بناءً على توزيع الفلورسنت.
النتائج الرئيسية
- تظهر GUVs حالات طور مميزة بناءً على ظروف المحلول.
- يتأثر سلوك الطور بكل من الملوحة وعدم التماثل عبر الغشاء.
- تسمح الطرق التي تم تطويرها بالتجربة المحكومة تحت الظروف الفسيولوجية.
- توفر النتائج رؤى حول ديناميكيات الغشاء ذات الصلة بالبيئات الخلوية.
الاستنتاجات
- تسلط الدراسة الضوء على أهمية الظروف الفسيولوجية في أبحاث الغشاء.
- يمكن أن يسهم فهم الفصل بين الطور في GUVs في دراسات غشاء الخلية.
- يمكن أن يبني البحث المستقبلي على هذه الطرق لاستكشاف النظم البيولوجية المعقدة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Understanding membrane phase behavior under physiological solution conditions is critical for de-risking target validation in membrane-associated drug discovery. This protocol enables assessment of how high-salinity and transmembrane asymmetry influence lipid domain stability, providing predictive confidence in early-stage mechanistic studies. By modeling physiologically relevant membrane environments, the approach supports translational continuity from discovery to preclinical evaluation of compounds targeting membrane proteins or lipid-dependent pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how solution conditions modulate lipid raft formation, informing hypotheses about membrane protein localization and signaling complex assembly.
- Operational Value: Enables controlled testing of transmembrane asymmetry effects, reducing false positives in target engagement assays conducted under non-physiological buffer conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates phase-separated GUVs as reproducible models for evaluating compound partitioning into liquid-ordered or liquid-disordered domains.
- Operational Value: Standardizes vesicle preparation under symmetric or asymmetric high-salinity conditions, improving assay robustness for fluorescence-based membrane interaction screens.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links in vitro phase behavior to physiological relevance, supporting risk-adjusted advancement of leads whose activity depends on membrane microenvironment.
- Operational Value: Provides a scalable method to assess temperature-dependent phase transitions, enabling correlation with preclinical efficacy or toxicity signals under varying physiological conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where membrane target validation requires mechanistic de-risking of lipid-dependent mechanisms, particularly for targets implicated in lipid raft-mediated signaling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding how solution asymmetry influences domain formation and protein recruitment to specific lipid phases.
- Screening: Delivers assay-ready GUV populations with quantifiable phase states, enabling reliable comparison of compound effects across solution conditions.
- Analytics: Produces fluorescence-based domain partitioning metrics that help teams compare compound behavior in ordered versus disordered membrane phases.
- Translational Research: Connects GUV phase stability to physiological temperature and salinity ranges, informing preclinical model selection for membrane-targeted interventions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for evaluating membrane microenvironment effects across multiple projects, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by revealing how ionic strength and gradient conditions alter membrane material properties relevant to drug binding.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized GUV formation and solution exchange protocols, minimizing variability in membrane-based assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying compounds whose activity is sensitive to physiological solution conditions, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of membrane-associated targets based on validated phase behavior under realistic extracellular and intracellular milieus.
Implementation Considerations
- Expertise in lipid film hydration, vesicle formation, and fluorescence microscopy interpretation is required to ensure accurate phase state assessment.
- Access to microfluidic systems and temperature-controlled chambers is necessary for implementing asymmetric solution conditions and thermal variation studies.
- Standardization across teams depends on consistent lipid composition, vesicle size selection, and imaging parameters to maintain comparability of phase state data.
- Adaptation to other model systems (e.g., different lipid mixes or protein-reconstituted vesicles) should consider potential alterations in phase transition temperatures and domain stability.
- Practical limitations include the need for careful avoidance of vesicle dilution during solution exchange and potential photobleaching during prolonged fluorescence imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Giant Unilamellar Vescicle (GUV) Preparation
3:02
Phase State Assessment with Fluorescence Microscopy
4:33
GUV Observation and Imaging with a Microfluidic Device
7:35
GUV Observations at Varying Temperatures
8:29
Results: GUV Phase Behavior
9:42
Conclusion
