استخدام في فيفو والأنسجة والخلايا Explant نهج لدراسة Morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والولادة

بروتوكولات لدراسة الابهر مورين الجنينية والولادة باستخدام الاستنساخ في فيفو تحليل وتعيين مصير و explants الابهري العضلات الملساء المعزولة مفصلة الخلايا هنا. هذه النهوج المختلفة تسهيل التحقيق في morphogenesis الشريان الاورطي الجنينية والفترة المحيطة بالولادة في التطور الطبيعي والتسبب في المرض.

الهدف العام من هذه الإجراءات هو دراسة تكوين جدران الأبهر الجنينية والفترة المحيطة بالولادة أثناء التطور الطبيعي وكذلك الاضطرابات في هذه العملية أثناء المرض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال نمو الأوعية الدموية مثل مصدر الخلايا التي تساهم في وسط الأوعية الدموية الجنينية والفترة المحيطة بالولادة. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها تسمح بتقييم التسبب في العضلات الملساء والتشكل الذي يحدث خلال مراحل التطور الجنينية والفترة المحيطة بالولادة.

ينبع تأثير هذه التقنيات على علاج أمراض الأوعية الدموية مثل تضيق الأبهر فوق اللعني للمرض الدوري الذي يسبب الإفراط في إنتاج خلايا السومو. سيتم إجراء عملية وضع المضخة المصغرة من قبل الدكتور جياسنغ تشانغ ، عالم أبحاث يدير نواة الجراحة المجهرية وجامعة ييل. ابدأ بإعداد أزواج تزاوج بين الفئران التي تتراوح أعمارها بين شهرين وستة أشهر مع Cre ER والفئران مع مراسل cre.

باستخدام مسبار معدني ، تحقق من وجود سدادات مهبلية كل صباح ، وافصل الأنثى عن الذكر عند اكتشاف سدادة. للتحريض الجنيني المبكر ، قم بحقن تاموكسيفين داخل الصفاق في رطوبة الحامل. لتحديد الخلايا في منتصف فترة الحمل إلى أواخرها وتتبع مصيرها أو استنساخها في فأر ما بعد الولادة ، قم بحقن هرمون البروجسترون في التجويف داخل الصفاق للحامل رطبا بشكل غير كفء مع تاموكسيفين بنسبة جرعة واحدة إلى جرعتين.

لحصاد الأجنة في التاريخ الجنيني المناسب ، قم بتنظيف البطن من الحامل رطبا بنسبة 70٪ من الإيثانول واستخدم المقص لفتح البطن لإزالة الرحم. اجمع الأجنة من الرحم باستخدام ملقط ومجهر ستيريو لفصلها بعناية عن المشيمة وكيس الصفار. ثبت الأجنة في 4٪ بارافورمالدهيد عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين.

تليها ثلاث غسلات في PBS لإزالة المثبت الزائد. بعد الغسيل الثالث ، احتضان الأجنة في 30٪ من السكروز في PBS ، في أنابيب فردية سعة 15 مليلتر حتى تغرق الأجنة. بعد ذلك ، املأ قوالب التجميد البلاستيكية بمركب درجة حرارة القطع الأمثل حتى ثلثي الحجم الأقصى وضع جنينا واحدا عموديا في كل قالب.

بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بتجميد الأنسجة في وضع مستقيم في حمام ثلج جاف بنسبة 70٪ من الإيثانول واضبط درجة حرارة ناظم البرد على 22 درجة مئوية. قم بتقسيم كتل الأنسجة لتوليد شرائح أنسجة عرضية بسمك 10 إلى 20 ميكرومتر من خلال كل شريان أورطي بالكامل ، مع التقاط كل قسم على شريحة مجهر زجاجي فور الحصول عليها. عندما يتم الحصول على جميع العينات ، جفف الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل التخزين بدرجة حرارة 80 درجة مئوية.

لتلطيخ عينات الأنسجة ، قم بإذابة الشرائح في درجة حرارة الغرفة ، وحمايتها من الضوء لتجنب تبييض الفلوروفور وغسل الشرائح في 0.1٪ PBS twin 20. للتحليل النسيلي ، قم بتلطيخ الأنسجة بصبغة نووية مناسبة وقم بتصوير الفوروفورات الأخرى لمراسل قوس قزح cre مباشرة على مجهر الفلورسنت. لرسم خرائط المصير ، باستخدام مراسل mTmG cre ، تصور تعبير GFP عن طريق التصوير المباشر مع أو بدون تلطيخ مناعي.

لزراعة الشريان الأورطي الجنيني وإخراجه ، ضع الجنين في وضع ضعيف وقم بتأمين الأطراف الممتدة في لوح تشريح تحت مجهر مجسم. باستخدام المقص ، قم بعمل شق رأسي من البطن عبر القص إلى الصدر العلوي. قم بتشريح أجود الرئتين القصبيين والمريء والكبد والأمعاء.

استخدم الملقط لسحب القلب برفق بطنيا باستخدام المقص لتشريح الشريان الأورطي بعيدا عن الجانب الظهري للتجاويف الصدرية والبطنية. اقطع الشريان الأورطي عند الجذر القريب ووضعيات البطن البعيدة لتحريره ووضع الشريان الأورطي المحصود في PBS معقم بارد في غطاء مزرعة الخلايا. بعد غسل قصير ، انقل الشريان الأورطي إلى بئر واحد من صفيحة 24 بئرا ، تحتوي على وسط DMEM مكمل بنسبة 0.5٪ PBS وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة تصل إلى 24 ساعة.

في نهاية الحضانة ، اغسل الشريان الأورطي مرتين باستخدام PBS وقم بإصلاح الأنسجة في 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 20 دقيقة. بعد ثلاث غسلات أخرى من PBS ، انقل الشريان الأورطي إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر يحتوي على 30٪ سوكروسين PBS حتى تغرق الأنسجة. لعزل خلايا العضلات الملساء في الفترة المحيطة بالولادة ، استخدمي إبرة قياس 23 لثقب البطين الأيسر لفأر ما بعد الولادة 0.5 واستخدمي أنبوبا بلاستيكيا لتوصيل الإبرة بحقنة معقمة تحتوي على PBS ، مثبتة عموديا في وضع مرتفع ، بحيث يتدفق PBS إلى البطين الأيسر عن طريق الجاذبية.

عندما يبيض الكبد ، استخدم الملقط لإزالة الأنسجة العرضية على السطح الخارجي للشريان الأورطي وحصاد الشريان الأورطي كما هو موضح للتو. قم بفصل أنسجة الأبهر في 500 ميكرولتر من محلول الهضم مع رج يدوي كل خمس إلى 10 دقائق. بعد 45 دقيقة ، انقل الأنبوب إلى غطاء مزرعة الخلايا المعقم واستخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لترتريفات ملاط الأنسجة حتى يتم الحصول على تعليق خلية واحدة.

انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ثم أضف ملليلترين من DMEM واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. إعادة تعليق الحبيبات في ثلاثة ملليلتر من وسط ثقافة خلايا العضلات الملساء وبذر الخلايا على 35 لوحة ثقافة ملليمتر. بعد ذلك ، ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية ، مع تحديث وسط زراعة الخلايا كل ثلاثة أيام.

لوضع مضخة صغيرة تناضحية تحت الجلد ، ابدأ بحلق الجزء السفلي من ظهر الفأر المخدر باستخدام مقصات الشعر وضع الفأر في وضع الانبطاح على صفيحة جراحية ساخنة. افرك الظهر بكحول البيتادين والأيزوبروبيل وضع الماوس تحت مجهر استريو. بعد ذلك ، استخدم مشرطا لعمل شق جلدي أفقي من 0.5 إلى سنتيمتر واحد تقريبا من ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات منقارية إلى قاعدة الذيل ، دون إصابة العضلة الأساسية.

أدخل الإرقاء في الشق وافتح وأغلق فكي الإرقاء لإنشاء جيب تحت الجلد. أدخل مضخة صغيرة تناضحية مملوءة بالعامل محل الاهتمام في الجيب واستخدم 6 خيوط غير قابلة للامتصاص لإغلاق الشق. ثم اسمح للفأر بالتعافي مع المراقبة حتى تحقيق الهبوط القصي.

الأجنة المتحولة للجين الذي يشفر بروتين المصفوفة خارج الخلية ، يتراكم الإيلاستين خلايا العضلات الملساء الزائدة في الطبقات الداخلية للشريان الأورطي ، بدءا من اليوم الجنيني 15.5. يشير التحليل النسيلي لخلايا العضلات الملساء باستخدام مراسل cre متعدد الألوان خلال هذه العملية ، إلى أن الخلايا متعددة الألوان وبالتالي فهي متعددة النسيلة. يكشف التلوين المناعي لأقسام الشريان الأورطي المزروع أن الإيلاستين الجنيني المتحور في اليوم 15.5 يصبح مفرط العضلات وضيق في غضون 18 ساعة من الثقافة ، وهي عملية يتم تخفيفها بإضافة جسم مضاد مضاد مضاد مضاد للأنتيجرين بيتا ثلاثة.

تعبر خلايا العضلات الملساء المعزولة عن الشريان الأورطي للفئران البرية التي بعد يوم الولادة 0.5 عن علامات خلايا العضلات الملساء ولكن ليس CD31. التسريب المستمر لمثبطات إنتجرين بيتا ثلاثة في الرطوبة الحامل بدءا من اليوم الجنيني 13.5 ، يخفف بشكل كبير من تضيق الأبهر وفرط العضلات في الفئران المتحولة لبروتين المصفوفة خارج الخلية ، الإيلاستين. لكن لا تغير الشريان الأورطي للفئران البرية.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال تقنية وضع المضخة الصغيرة التناضحية في أقل من 10 دقائق إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذه الإجراءات ، يمكن أيضا استقراء هذه الأساليب لدراسة العضلات الملساء المشفرة وغير الوعائية مثل أنسجة الجهاز الهضمي أو مناطق الرئة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء رسم خرائط الملاءمة الجنينية في الجسم الحي والتحليل النسيلي ، وزراعة الشريان الأورطي الجنيني المزروع ، وخلايا العضلات الملساء الأبهري في الفترة المحيطة بالولادة ، واستخراج المضخات الصغيرة التناضحية تحت الجلد.

لا تنس أن العمل مع الفئران والتاموكسيفين والمخفض الثابت يمكن أن يكون خطيرا وأن الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعطف المختبر وتوخي الحذر الشديد يجب دائما اتخاذها أثناء تنفيذ هذه الإجراءات.