يعيش تصوير خلايا قشرة الدماغ الأولية باستخدام نظام ثقافة 2D

الهدف العام من هذه التجربة هو مراقبة سلوكيات الخلايا أثناء تطور النسب من الخلايا الجذعية العصبية إلى الخلايا العصبية أو الخلايا الدبقية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في مجال النمو العصبي مثل دور الانقسامات الخلوية المتماثلة وغير المتماثلة وإطالة دورة الخلية ومعدلات نمو الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بمراقبة نسب الخلية لفترات طويلة.

هذا يسمح بملاحظة التحول من تكوين الخلايا العصبية إلى التكوين الدبقي داخل سلالة واحدة والتجميع المباشر للأسلاف العصبية والدبقية تحت الخطية. ابدأ بإزالة الأدمغة من 5 إلى 10 أجنة e14 في طبق بتري مع وسط تشريح بارد. استخدم الملقط لسحب الجلد والجمجمة بعناية وعزل الدماغ.

أثناء العمل تحت المجهر المجسم ، استخدم ملقط التشريح لإزالة السحايا. ثم قم بتقسيم telencephalon في المنتصف لفصل نصفي الكرة الأرضية. لعزل الدماغ الظهري الجانبي ، قم بقص المنحنى الظهري وحدود pallio و subpallium.

انقل الدماغ الظهري الوحشي إلى أنبوب 2 مل مع وسط تشريح على الجليد حتى يتم تشريح جميع الأدمغة. بعد التشريح الدقيق للدماغ الظهري الجانبي ، ضع الأنسجة في أنبوب مخروطي 15 مل. ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة المجمعة في وسط تشريح بارد لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية و 340 مرة جم لترسيب الأنسجة.

بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية بماصة وأضف 1 مل من 37 درجة مئوية 0.05٪ Trypsin-EDTA للهضم الكيميائي. احتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، أضف 2 مل من وسط التكاثر لتثبيط نشاط Trypsim.

بعد ذلك ، قم بتلميع طرف ماصة باستور الزجاجية فوق موقد غاز أو موقد بنسن لبضع ثوان لتضييق الفتحة قليلا. أسبيرات FCS لتغطية طرف الماصة. ثم قم بفصل الخلايا ميكانيكيا عن ماصة باستور المصقولة بالنار والمغلفة ب FCS عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل مع توخي الحذر لتجنب توليد الفقاعات.

قم بالطرد المركزي للخلايا المنفصلة لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية عند 340 مرة G.قم بإزالة المادة الطافية بماصة ، ثم أضف ملليمترا واحدا من وسط التكاثر وأعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة. قم بإزالة PBS من اللوحة المعالجة مسبقا باستخدام Poly-D-Lysine. ثم ارسم علامة في الجزء السفلي من اللوحة يمكن استخدامها كمرجع لتحديد نقطة الصفر.

بعد إعادة تعليق الخلايا في وسط التكاثر للمرة الثانية ، قم بإعداد تخفيف واحد لواحد لتعليق الخلية باستخدام محلول تريبان أزرق بنسبة 0.4٪. قم بالتحميل في شرائح غرفة العد واحسب عدد الخلايا القابلة للحياة غير الملوثة. ستكون الخلايا غير القابلة للحياة زرقاء.

خفف الخلايا في وسط التكاثر للحصول على 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليمتر. أضف 500 ميكرولتر من معلق الخلية إلى كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة 24 بئر واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتصوير الخلايا المنقولة بالفيروسات القهقرية ، ضع لوحة زراعة الأنسجة في غرفة تصوير متصلة بأجهزة التحكم في درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون للحفاظ على الخلايا في ظروف ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

حدد موضعا في المحور xy ليكون بمثابة نقطة صفر ومعايرة نقطة الصفر. حدد من 10 إلى 15 وضعا لكل بئر ليتم تصويرها بتكبير 10 أضعاف. اضبط البرنامج على طلب صور تباين الطور كل خمس دقائق وصور مضان كل ثلاث ساعات لتقليل السمية الضوئية.

تحقق واضبط التركيز في الساعات الثلاث الأولى من التجربة لأنه قد يتغير أثناء توازن درجة الحرارة. بعد سبعة أيام ، أوقف الاستحواذ وانتقل إلى الكيمياء المناعية بعد التصوير. ابدأ تشغيل برنامج تتبع الخلايا واختر اسم مستخدم.

انقر فوق اختيار اسم المستخدم الخاص بك وتابع. تصفح وحدد مجلد عمل tTt لحفظ أشجار النسب والإحصائيات والصور المصدرة. بعد ذلك ، حدد التجربة المراد تحليلها وتحميلها.

إذا تم تحويل الصور مسبقا بواسطة محول tTt ، فانقر فوق محول ملف السجل وحدد عدد الثواني بين نقطتين زمنيتين متتاليتين في نافذة محول ملف السجل. انقر فوق تحويل ملفات السجل للتجربة بأكملها. حدد الصور المطلوبة وقم بتحميلها يدويا أو باستخدام الخيار المعروض في البرنامج.

حدد ملف ، فتح ، مستعمرة جديدة. انقر فوق التتبع ، متبوعا ببدء التتبع لبدء التتبع في الموضع المختار. ستظهر نافذة فيلم.

حدد الخلية التي تستخدم دائرة التتبع واضغط على مفتاح الصفر. سينتقل البرنامج إلى الإطار التالي. استمر في وضع دائرة التتبع حول خلية المسار باستخدام الماوس وانقر فوق الصفر في كل إطار لإضافة علامة تتبع على الخلية.

استخدم المفتاحين الأول والثالث للانتقال إلى الإطار السابق أو التالي. لحذف علامة المسار ، ما عليك سوى النقر فوق الموضع الصحيح لوضع علامة على الصفر والضغط عليه. إذا كانت الخلية مقسمة ، فحدد التتبع ، وإيقاف السبب ، والقسمة ، واستمر في تتبع خلية ابنة واحدة عن طريق تحديد إحدى الخلايا في نافذة محرر الخلية ، ثم حدد التعقب ، ابدأ التتبع.

لتعقب الخلية الفرعية الثانية، حددها في محرر الخلية واضغط على F2. إذا ماتت الخلية أثناء الفحص المجهري بالفيديو، فحدد موت الخلايا المبرمج. إذا غادرت الخلية مجال الملاحظة أو اختلطت مع الخلايا المجاورة التي تمنع التتبع، فحدد مفقود. لإيقاف التتبع والمتابعة لاحقا ، انقر فوق مقاطعة.

في نافذة محرر الخلية ، سيتم إنشاء شجرة أثناء التتبع. لحفظ شجرة النسب ، حدد ملف ، حفظ ، الشجرة الحالية في نافذة محرر الخلية. لتصدير الفيلم مع بيانات التتبع، قم بإيقاف تشغيل وضع التتبع، وفي نافذة الفيلم حدد تصدير الفيلم.

قم بإعداد نطاق تنسيق الإطارات وعدد الإطارات في الثانية ومعدل البت. انقر فوق بدء التصدير. تظهر الصور المجهرية التالية تباين الطور في صور الفلورسنت GFP لثقافة خلايا قشرة المخ الأولية.

تعبير GFP غائب خلال الساعات الأولى من التصوير. يزداد عدد الخلايا التي تعبر عن GFP بمرور الوقت وتزداد شدة مضان GFP كما هو موضح بالسهم الأصفر في هذه الصور. تظهر صورة التكبير الأعلى هذه في المنطقة المعبأة من الصورة السابقة الخلايا التي تعبر عن GFP بالتفصيل.

تظهر صور تباين الطور هذه مثالا على انقسام الخلايا. يظهر هنا تقريب خلايا الأسلاف متبوعا بانقباض غشاء الخلية وأخيرا اكتمال الانقسام. هذا مثال على شجرة نسب خلية واحدة.

تشير الأسهم الملونة إلى أوضاع مختلفة لانقسام الخلايا ، ويظهر الانقسام التكاثري المتماثل بالسهم الأصفر. يشار إلى القسمة غير المتماثلة بالسهم الأزرق. يظهر الانقسام الطرفي المتماثل بالسهم الأحمر ويشير X إلى موت الخلية.

تشير الأرقام إلى طول دورة الخلية لخلايا الأسلاف. يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعة إلى ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إظهار سلوكيات الخلايا أثناء تطور سلالة الخلايا الجذعية للخلايا الجذعية إلى الخلايا العصبية أو الخلايا الدبقية.