تحديد محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء

هنا، نقدم مقايسة موثوقة وسهلة لقياس محتوى الجليكوجين في الخلايا السيانوباكتريال. الإجراء ينطوي على هطول الأمطار، اختيار البلمرة، والكشف عن بقايا الجلوكوز. هذا الأسلوب هو مناسبة لكل من ويلديب والسلالات المعدلة وراثيا ويمكن أن تسهل الهندسة الأيضية من البكتيريا الزرقاء.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء باستخدام التحلل المائي الانتقائي والفحص القائم على الإنزيم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال البكتيريا الزرقاء ، مثل علم وظائف الأعضاء وعلم الوراثة الجزيئية والهندسة الحيوية لسلالات البكتيريا الزرقاء المختلفة قيد التحقيق. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتكيف مع نطاق صغير ، وسهلة الأداء ، وحساسة للغاية ومحددة للجليكوجين.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للبكتيريا الزرقاء ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الكائنات الحية الدقيقة الأخرى التي تتراكم الجليكوجين أو النشا ، مثل الإشريكية القولونية والخميرة والطحالب الدقيقة والعديد من الكائنات الحية الدقيقة غير المتجانسة والضوئية. ابدأ هذا البروتوكول بإعداد مزارع البكتيريا الزرقاء كما هو موضح في بروتوكول النص. نقل مليلتر واحد من مزرعة البكتيريا الزرقاء أو تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

ثم جهاز الطرد المركزي عند 6 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية قبل تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من 50 ملليمولار Tris-HCL درجة الحموضة ثمانية. الطرد المركزي الحبيبات المعلقة كما كان من قبل.

تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية مرة ثانية في المخزن المؤقت Tris-HCL. الطرد المركزي الأنابيب كما كان من قبل وتخلص من المادة الطافية. ثم أعد تعليق الحبيبات تماما في 500 ميكرولتر من 50 مللي مولار Tris-HCL عازلة الأس الهيدروجيني ثمانية.

من الأهمية بمكان تعليق الحبيبات جيدا من أجل تحلل فعال. احتفظ بإعادة التعليق في الجليد. قم بعمل الخلايا المعلقة عند أربع درجات مئوية بمقدار 30 دورة من الموجات فوق الصوتية مع كل دورة تتكون من 30 ثانية بتردد 20 كيلو هرتز بسعة قصوى ، تليها 90 ثانية بدون.

جهاز الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على المحللة عند 6 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي ، يجب أن تكون الحبيبات عبارة عن حطام خلية كبير بشكل أساسي ، ويتم استخدام المادة الطافية لمزيد من التحليل. في هذه المرحلة ، حدد تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين.

قم بإزالة الكلوروفيل أ من محللة الخلية عن طريق خلط 900 ميكرولتر من الإيثانول و 100 ميكرولتر من المادة الطافية التي تم الحصول عليها في أنبوب غطاء لولبي سعة 1.5 مل. بعد إغلاق الغطاء ، قم بتسخين الأنبوب على حرارة 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، باستخدام كتلة تسخين مختبرية قياسية. ثم احتضان الأنبوب في الثلج لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 20 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية. تحتوي الحبيبات على الجليكوجين.

جفف الحبيبات برفق في الهواء لإزالة الإيثانول الزائد. لا تجفف الحبيبات بشكل مفرط لتجنب صعوبة إذابتها. قم بقياس الامتصاص عند 666 نانومتر من المادة الطافية التي تم الحصول عليها لتحديد محتوى الكلوروفيل أ.

يمكن استخدام القيمة لتطبيع محتوى الجليكوجين. قم بإذابة الحبيبات في 100 ميكرولتر من 50 مللي مولار من أسيتات الصوديوم الرقم الهيدروجيني خمسة. امزج هذه المواد جيدا باستخدام دوامة.

لا ينصح بالخلط عن طريق سحب العينات لأن الخليط لزج. أضف أيضا 50 ميكرولترا من ثماني وحدات لكل مليلتر من أميلوجلوكوزيداز و 50 ميكرولترا من وحدتين لكل مليلتر من ألفا أميليز. بعد ذلك ، احتضان الخليط عند 60 درجة مئوية في كتلة تسخين لمدة ساعتين لتمكين هضم الجليكوجين في جزيئات الجلوكوز.

بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 20 ، 000 مرة جم لمدة خمس دقائق وانقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. قم بقياس تركيز الجلوكوز في المادة الطافية بعد التحلل المائي الأنزيمي باستخدام كاشف GOD-POD. انقل 100 ميكرولتر من المادة الطافية من خطوة ترسيب الجليكوجين إلى بئر في طبق 96 بئر.

كعنصر تحكم سلبي ، استخدم 100 ميكرولتر من 50 مللي مولار أسيتات الصوديوم درجة الحموضة خمسة. لتوليد منحنى المعايرة ، قم أيضا بقياس محاليل الجلوكوز القياسية. أضف 150 ميكرولترا من كاشف GOD-POD إلى كل عينة واخلطها بسرعة عن طريق سحب العينات.

احتضن الطبق على حرارة 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، سجل قيمة الامتصاص عند 510 نانومتر باستخدام قارئ لوحة. احسب كمية الجليكوجين كمكافئ للجلوكوز ، باستخدام منحنى المعايرة الذي تم الحصول عليه من معايير الجلوكوز.

محتويات الجليكوجين في synechocystis هنا. تمت مقارنة السلالتين الطافيرتين ، دلتا بي إم جي أ ودلتا بي إم جي آر ، اللتان من المعروف أنهما يتراكمان الجليكوجين بشكل مفرط ، بسلالة النوع البري. كما هو متوقع ، أظهرت السلالات الطافرة مستويات مرتفعة من الجليكوجين.

على العكس من ذلك ، فإن الطفرة التي تفتقر إلى سينسيز الجليكوجين لم تتراكم الجليكوجين. تم تصميم السلالات المستخدمة هنا لإنتاج المانيتول. والجدير بالذكر أن طفرة سينسيز الجليكوجين أنتجت مانيتول أكثر من سلالة التحكم ، مما يشير إلى أن الكربوهيدرات التي يتم تصنيعها عن طريق عملية التمثيل الضوئي يتم إعادة توجيهها إلى المانيتول في السلالة الطافرة التي تفتقر إلى القدرة على تصنيع الجليكوجين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على تحديد محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء كميا في خمس ساعات. عند تنفيذ هذا الإجراء, من المهم أن تتذكر إعادة تعليق الخلايا تماما وإذابة كريات الجليكوجين للحصول على نتائج موثوقة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات نشاط الإنزيم الأيضي باستخدام محللات الخلايا المتبقية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل كيفية تنظيم استقلاب الكربوهيدرات في البكتيريا الزرقاء.