سحب الأنابيب النانوية الأغشية من الحويصلات أونيلاميلار العملاقة

الهدف العام من منهجية سحب الأنابيب النانوية هذه هو دراسة التفاعلات بين بروتينات معينة ذات أهمية والأغشية المنحنية للغاية كميا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي في بيولوجيا أغشية الخلايا ، مثل الالتقام الخلوي والاتجار داخل الخلايا. تسمح لنا هذه التقنية بتحديد كيفية ارتباط البروتينات بالأغشية المنحنية بشكل مباشر وتشويهها بشكل متبادل.

في البداية ، تم استخدام هذه الطريقة لقياس الخواص الميكانيكية الأساسية للأغشية الدهنية. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيقه لتوضيح الآليات المهمة في تفاعلات غشاء البروتين ، وخاصة أغشية تشكيل البروتين. ابدأ بجمع الحويصلات الأحادية العملاقة مباشرة من الأسلاك البلاتينية لغرفة التكوين الكهربائي.

لبناء الغرفة التجريبية ، ضع غطاءين زجاجيين مستطيلين على بعد ملليمتر واحد على قاعدة معدنية ، مع ترك فتحات على طول الحواف الطويلة كبيرة بما يكفي للسماح لطرف الماصة الدقيقة الزجاجية بالوصول إلى مركز الغرفة على الأقل. املأ كل من الغرفة التجريبية والماصة الدقيقة الزجاجية بخمسة ملليغرامات لكل ملليلتر من محلول بيتا كازين عالي النقاء، مع الحرص على تجنب الفقاعات. أثناء تخميل الحجرة، قم بتثبيتها على مجهر ضوئي متمركز فوق الهدف، وأدخل طرف ماصة الشفط الدقيقة من خلال الفتحة على طول الحافة الطويلة حتى يصبح الطرف فوق الهدف.

اضبط مستوى خزان المياه بحيث يكون ضغط الشفط قريبا من الصفر، واملأ ماصة دقيقة للحقن بجزيء الاهتمام المذاب في المخزن المؤقت التجريبي بالتركيز التجريبي المناسب. قم بتركيب ماصة الحقن الدقيقة داخل معالج دقيق، وأدخل الماصة الدقيقة من خلال الجانب الآخر من الغرفة التجريبية. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة محلول بيتا كازين من الغرفة ، واشطف الغرفة عدة مرات باستخدام عازلة تجريبية.

بعد ذلك ، أضف بضعة ميكرولترات من محلول الحويصلة إلى الغرفة ، متبوعا ببضعة ميكرولترات من الخرز المطلي بالستربتافيدين ، إلى تركيز نهائي يبلغ 0.1 في 10 إلى معدل حبة سالب 3٪ لكل حجم أو أقل. بعد أن تستقر الحويصلات والخرز في قاع الغرفة ، اترك المخزن المؤقت التجريبي يتبخر لمدة 15 دقيقة تقريبا ، وعند هذه النقطة يجب أن تتموج الحويصلات بشكل واضح تحت المجهر الضوئي. عندما تكون الحويصلات مرنة بشكل مناسب، قم بشفط الحويصلات الفردية في الماصة الدقيقة حتى تصبح أطوال الأغشية داخل الماصة مساوية أو أكبر من نصف قطر الماصة.

عندما يتم تحديد لسان الشفط بحجم مناسب ، أغلق الحواف المفتوحة للغرفة بالزيت المعدني. لضبط الوضع الصفري لضغط الشفط، ضع نهاية ماصة الشفط بالقرب من حبة، واضبط ارتفاع خزان المياه بحيث لا يتم امتصاص الخرزة أو تفجيرها بواسطة الماصة. يعد ضبط ارتفاع الماء أمرا بالغ الأهمية للتحكم في توتر غشاء الحويصلة التي يتم استنشاقها بواسطة الماصة الدقيقة.

استنشق حويصلة وحرك الماصة الدقيقة لأعلى وبعيدا عن التركيز البؤري دون كسر الماصة الدقيقة. باستخدام ملاقط بصرية ، قم باصطياد حبة على بعد حوالي 20 ميكرومتر من قاع الغرفة. أعد الحويصلة إلى التركيز بعيدا عن الخرزة ومحاذاة المصيدة البصرية ، وسجل حركة الخرزة لمدة دقيقة إلى دقيقتين لقياس موضع التوازن.

قلل الضغط داخل الماصة الدقيقة قدر الإمكان دون فقدان الحويصلة لتقليل توتر الغشاء ، واجعل الحويصلة ملامسة بعناية للحبة لمدة ثانية تقريبا لإنشاء روابط الستربتافيدين والبيوتين. بعد ذلك ، باستخدام مشغل بيزو ، اسحب الحويصلة برفق للخلف لإنشاء أنبوب نانوي. قم بزيادة ضغط الشفط لإعادة إنشاء لسان الشفط ومحاذاة الأنبوب داخل محور ماصة الشفط.

اجعل الأنبوب والحويصلة في بؤرة التركيز بالكامل ، وسجل حركة الخرزة بسرعة اكتساب 30 هرتز وارتفاع خزان المياه فيما يتعلق بموضع الصفر لبضع دقائق تحت الفحص المجهري للمجال الساطع. عندما يتم الحصول على جميع الصور ، سجل حركة الخرزة مرة أخرى عند ضغوط الشفط المختلفة وتوترات الغشاء. لحقن البروتينات أو الجزيئات ذات الأهمية ، قم بإحضار ماصة الحقن الدقيقة بالقرب من الأنبوب النانوي ، مع الحرص على عدم اضطراب الخرزة الموجودة في المصيدة البصرية ، وحقن البروتينات برفق عند ضغط واحد إلى اثنين من الضغط.

بعد أن يتوازن ارتباط البروتين ، كرر القياسات التدريجية في وجود البروتينات المضافة ، كما هو موضح للغشاء العاري. قياسات القوة ونصف القطر على الأنابيب النانوية المسحوبة من حويصلات DOPC بنسبة 100٪ مستقلة ، حيث يتم قياس القوة من إزاحة الخرزة في المصيدة البصرية ونصف القطر من شدة التألق ، مما يوفر طريقتين لحساب صلابة ثني الغشاء. يشير التخصيب النسبي لبروتينات قناة البوتاسيوم أو BAR على أنابيب الغشاء فوق الحويصلات الأساسية إلى أن البروتينات أكثر عرضة للارتباط بالأغشية المنحنية.

في الواقع ، يؤدي ارتباط بروتين N-BAR endophilin A2 بالغشاء إلى تقليل قوة الأنبوب تدريجيا إلى الصفر ، مما يشير إلى تكوين سقالة ثلاثية الأبعاد تحافظ على استقرار الأنبوب. باتباع هذا الإجراء ، يمكن دمج تقنيات أخرى للإجابة على أسئلة إضافية ، على سبيل المثال ، الفحص المجهري عالي الدقة للكشف عن تنظيم البروتين على أنابيب الغشاء أو تتبع الجسيمات المفردة لقياس حركة البروتين.