[كنفوكل] التصوير من Neuropeptide Y-فلورين: تقنية لتصور الأنسولين الحبيبية للرقابة في الجزيرات سليمة مورين والبشرية

الهدف العام من هذا المقايسة هو تصور عملية الإخراج الخلوي لحبيبات الأنسولين في الوقت الفعلي في جزر بنكرياسية سليمة باستخدام المجهر البؤري. ستجيب هذه الطريقة على أسئلة جوهرية في مجال مرض السكري؛ على سبيل المثال، ما الذي ينظم عملية الإخراج الخلوي للأنسولين؟

يُعد هذا الأمر بالغ الأهمية لأن اندماج الحبيبات هو الحدث الأكثر أهمية في حياة خلية بيتا. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنه يمكننا استخدام جزر بنكرياسية سليمة، مما يتيح لنا رؤية أحداث الاندماج في الخلايا ضمن بيئتها الأصلية. ستقوم مدينا محكموتوفا، طالبة الدكتوراه من مختبرنا، بشرح هذه التقنية.

في البداية، وعند وصول جزر البنكرياس، انقلها إلى أنابيب فالكون سعة 50 ملليلتر وقم بطرد مركّز معلق الجزر بسرعة 1,000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. ستتجمع الجزر في قاع الأنبوب، لذا انقل الجزر في 2 ملليلتر من وسط استنبات CMRL إلى أطباق بتري بقطر 35 مليمتر غير معالجة للاستنبات النسيجي، ثم حضنها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة قبل العدوى الفيروسية. بعد عزلها، أعد تعليق ما يقارب من مكافئات جزر البنكرياس الفأرية في 2 ملليلتر من وسط استنبات CMRL وانقلها إلى أطباق بتري بقطر 35 مليمتر غير مخصصة للاستنبات النسيجي.

يتم تحضين النسيج عند 37 degree celsius و5%carbon dioxide لمدة 24 ساعة قبل العدوى الفيروسية. ولإجراء العدوى الفيروسية، أضف من خمسة إلى 10 µL من الفيروس المخزن إلى كل طبق بتري مقاس 35 millimeter يحتوي على جزر بنكرياسية بشرية أو فئرانية في 2 mL من وسط استزراع CMRL. وبعد استزراع الجزر البنكرياسية لمدة 24 ساعة، يتم شفط الوسط واستبداله بـ 2 mL من وسط استزراع CMRL الخالي من الفيروس.

قم بزراعة الجزر لمدة تتراوح بين أربعة إلى ستة أيام، مع استبدال الوسط كل ثلاثة أيام. قم بتحضير المحلول خارج الخلوي عن طريق دمج الكواشف المدرجة هنا، ثم قم بتعقيم المنظم عن طريق الترشيح. قم بتحضير وسط جلوكوز أساسي بتركيز نهائي للجلوكوز يبلغ 3 millimolar، وذلك بإضافة 75 µL من مخزون الجلوكوز بتركيز 2 molar إلى 50 mL من المحلول خارج الخلوي.

بعد ذلك، لتحضير وسط فرط سكر الدم بتركيز نهائي للجلوكوز يبلغ 16 millimolar، أضف 400 µL من مخزون الجلوكوز بتركيز 2 molar إلى 50 mL من المحلول خارج الخلوي. قم بتخفيف أي محفزات إضافية ومحلول خارج خلوي يحتوي على 3 millimolar من الجلوكوز. قبل بدء التجربة، قم بمعالجة الشرائح الغطائية مسبقاً بـ 30 µL من محلول poly-d-lysine بتركيز 1 mg/mL واتركها في الحضانة لمدة ساعة واحدة.

ثم استخدم الماء لشطف شرائح الغطاء جيداً. وقبل ساعة واحدة على الأقل من التجربة، انقل مجموعة من الجزر إلى طبق بتري بقطر 35 مليمتر يحتوي على محلول خارج خلوي بتركيز 3 millimolar من الجلوكوز. احتفظ بالجزر المتبقية عند 37 °C و 5% carbon dioxide.

قبل بدء التجربة بـ 30 دقيقة، قم بتثبيت غطاء الشريحة في غرفة التصوير باستخدام الشحم السيليكوني لإحكام غلقه. ثم ثبت غرفة التصوير على منصة التصوير. بعد ذلك، وباستخدام الماصة، انقل من 20 إلى 30 جزيرة بنكرياسية إلى المنطقة المعالجة بـ poly-d-lysine من غطاء الشريحة، واترك الجزر تلتصق بالسطح لمدة 20 دقيقة.

تعد هذه الخطوة حاسمة لنجاح التجربة، حيث نجمع ما يقرب من 20 إلى 30 جزيرة في أقل من 10 µL من المنظم وننتظر لمدة 20 دقيقة. ومن المهم عدم السماح لشريحة الغطاء بالجفاف تماماً لتجنب تلف الجزر. وأثناء التصاق الجزر بشريحة الغطاء، يتم تحضير نظام التروية باستخدام الماء لشطفه جيداً.

ثم أضف كل محلول إلى قناة مختلفة، وفقاً لهذا الجدول. قم بإزالة جميع الفقاعات الهوائية من النظام عن طريق فتح كل قناة على حدة وترك المحلول يتدفق لبضع دقائق. تأكد من أن التدفق ثابت وأن الأنابيب لا تسرب.

بعد ذلك، قم بتوصيل سخان المحلول المضمن الوحيد بأنبوب مخرج التروية واضبط درجة حرارة المنظم المتدفق عند 37 degree celsius. ثم قم بتجهيز مضخة الشفط؛ حيث يتم توصيل الأنابيب وتشغيل المضخة والتأكد من سحب السائل.

ضع منصة التصوير التي تحتوي على الجزر على منصة المجهر وقم بتوصيلها بنظام التروية ومضخة الشفط. بعد ذلك، املأ حجرة التصوير برفق بالمحلول خارج الخلوي الذي يحتوي على 3 mM من الجلوكوز. لإجراء التصوير البؤري، حدد موقع الجزر في مجال المجهر باستخدام تكبير منخفض.

بمجرد التركيز على الجزر، انتقل إلى العدسات الشيئية ذات التكبير الأعلى. افتح برنامج الحصول على الصور وقم بتنشيط وضع المسح المقيم. اختر تصوير xyzt، ثم لتكوين إعدادات الحصول على الصور، قم بتشغيل ليزر الأرجون وضبطه على 30%، ثم خط الليزر 488 nanometer، مع ضبط قوة الليزر إلى حوالي 50% لإثارة pHluorin.

قم بجمع الانبعاث عند 505 إلى 555 نانومتر، باستخدام طيف انبعاث EGFP كدليل. اختر دقة تبلغ 512 في 512 بكسل. ابدأ التصوير بالضغط على زر العرض المباشر (live) واضبط مستويات الكسب (gain).

حدد بداية ونهاية مكدس z من خلال التركيز على الجزء العلوي من الجُزيرة واختيار "begin"، ثم الانتقال إلى آخر مستوى يمكن التركيز عليه واختيار "n". اختر حجم مكدس z بقيمة 5 µm. اضبط الفاصل الزمني لالتقاط كل مكدس z ليكون قريباً من 1.5 إلى 2 ثانية، واختر خيار "acquire until stopped" للتصوير المستمر.

بعد ذلك، اضغط على زر البدء لبدء التصوير. راجع البروتوكول النصي لمعرفة بروتوكولات التحفيز اللازمة لتحفيز الإخراج الخلوي للحبيبات. وباستخدام الماسح المدمج، يتم الحصول على صور بؤرية للجزر كـ تسجيلات مجمعة زمنياً في أقل من ثانيتين.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن دمج هذه التقنية مع صبغات التصوير الوظيفي، مثل صبغات جهد الغشاء أو صبغات الكالسيوم الحر في العصارة الخلوية. ولتحديد ما إذا كان NP Y-pHluorin أداة مناسبة بالفعل لمراقبة ديناميكيات حبيبات الإنسولين، تم إجراء صبغ مناعي للجزر المصابة باستخدام أجسام مضادة ضد GFP لـ NP Y-pHluorin وهرمونات الجزر وهي الإنسولين أو السوماتوستاتين أو الجلوكاجون. وكانت معظم الخلايا التي تعبر عن NP Y-pHluorin هي خلايا بيتا، حيث كانت تعبر أيضاً عن الإنسولين.

تم وسم عدد قليل فقط من خلايا ألفا الإيجابية للجلوكاجون أو خلايا دلتا الإيجابية للسوماتوستاتين باستخدام البروتين الفلوري الأخضر (GFP). ومن المهم ملاحظة أنه في الخلايا المصابة، حدث تمركز مشترك بين اندماج NP Y والأنسولين. يوضح هذا الشكل أن pHluorin يعد مستشعراً فعالاً للرقم الهيدروجيني (pH).

بما أن زيادة الرقم الهيدروجيني (pH) داخل الخلايا باستخدام كلوريد الأمونيوم بتركيز 50 millimolar أدت إلى زيادة في الفلورة داخل الخلايا بنسبة تتجاوز 500%. وبما أن الرقم الهيدروجيني داخل الحبيبات يرتفع عند الاندماج مع الغشاء البلازمي أثناء انفتاح مسام الاندماج، فإن الحبيبات التي تحتوي على NP Y-pHluorin تصبح مرئية تحت الظروف التي تحفز الإفراز الخلوي للأنسولين، مثل إزالة استقطاب الغشاء باستخدام كلوريد البوتاسيوم. وباستخدام التصوير الزمني المتتابع بالمجهر البؤري للجزر المصابة بـ NP Y-pHluorin، يمكن تصور أحداث إفرازية فردية في خلايا بيتا داخل الجزر السليمة.

تحدث هذه الاستجابات نتيجة لإزالة الاستقطاب المباشر للغشاء باستخدام كلوريد البوتاسيوم أو العديد من المحفزات الفسيولوجية الأخرى. وعند تركيز الجلوكوز خارج الخلوي الأساسي، يُلاحظ نشاط إفرازي ضئيل. ومع ذلك، يتم تحفيز اندماج الحبيبات مع الغشاء البلازمي استجابةً للتحفيز بالجلوكوز المرتفع.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل سبب حدوث اندماج الحبيبات في مناطق محددة من الخلية. وبعد تطويرها، استُخدمت هذه التقنية لاستكشاف النمط الزمني لإفراز حبيبات الإنسولين في مجموعات خلايا بيتا في الجزر البشرية.