الأمعاء C. ايليجانس "كنموذج" ل Morphogenesis التجويف بين الخلايا و في فيفو الاستقطاب نشوء غشاء حيوي على مستوى الخلايا المفردة: وضع العلامات تلطيخ جسم والخسارة [رني] من وظيفة تحليل وتصوير

الهدف العام من هذا المزيج من الطرق القياسية هو توضيح كيف يمكن استخدام أمعاء C.elegans للتحليل في الجسم الحي للتكوين الحيوي للغشاء المستقطب وتشكل التجويف على مستوى الخلية المفردة والخلوية الفرعية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات القطبية والتكوين الحيوي مثل كيفية إنشاء مجالات الغشاء القمي مقابل الأغشية القاعدية وعدم التناسق الخلوي الآخر والحفاظ عليه أثناء وبعد التشكل. الميزة الرئيسية لهذا النظام النموذجي هي أن هذه الطبقة المفردة الشفافة المكونة من 20 خلية فقط يمكنها البقاء على قيد الحياة في غرفة الأنسجة في الجسم الحي لتشريح الغشاء المستقطب أحادي الخلية والتكوين الحيوي للتجويف.

يمكن توسيع التقنيات لتشمل تحليل الأنماط الظاهرية الأخرى لتشكل C.Elegans ، وينصب التركيز هنا على تحليل التكوين الحيوي للأغشية ، وتحديدا على التكوين الحيوي للغشاء القمي والتجويف. تشمل الإجراءات تقنيات التصوير المكررة في الثابتة والحية للتمييز بين مجالات الأغشية والمكونات الخلوية الفرعية وتحديد الأنماط الظاهرية لتكوين التجويف في أمعاء C.elegans. يرافق هذا الفيديو عن تكوين الأنابيب المعوية مقطع فيديو عن نماذج تكوين الأنابيب في القناة الإخراجية حيث يتم تحليل التكوين الحيوي للأغشية المستقطبة.

فيما يتعلق بوضع العلامات على جيل المعدلة وراثيا ببروتينات الاندماج المصنفة بالفلورسنت للتصوير الحي ، تم وصفه في الفيديو المصاحب حول تحليل تكوين الأنابيب في القناة الإخراجية. يمكن استخدام هذه مباشرة في تجارب RNAi. عادة ما يكون الجيل الثالث هو الخطوة الأولى في هذا المزيج من الإجراءات.

يبدأ هذا الفيديو بطريقة وضع العلامات البديلة تلطيخ الأجسام المضادة التي يجب إصلاح لها. يمكن دمج إجراءات وضع العلامات المختلفة مع الكيمياء المناعية التي تستخدم عادة لتحليل التصوير النهائي. يحتوي هذا البروتوكول أيضا على أمثلة على علامات الأغشية الخاصة بالأمعاء والمحفزات والموارد الأخرى المفيدة لكل من إجراءات وضع العلامات.

بعد إظهار الكيمياء المناعية ، يستخدم هذا الفيديو سلالة معدلة وراثيا تصنف الغشاء القمي المعوي ب ERM-1 GFP للبحث عن القطبية والأنماط الظاهرية لتشكل التجويف باستخدام RNAi. قم أولا بإعداد شريحة لإصلاح الديدان. ماصة 30 ميكرولتر من بولي إل ليسين على شريحة ثم ضع شريحة ثانية على الأخرى وقم بإسقاطها معا لتوزيع المحلول بالتساوي على كليهما.

الآن انزع الشريحتين واتركهما يجففان في الهواء لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، ضع كتلة معدنية مسطحة في وعاء مملوء بالنيتروجين السائل. اغسل الألواح بمحلول M9 وانقل حوالي 10 ميكرولترات من M9 التي تحتوي على الديدان.

بدلا من ذلك ، اختر الديدان وأضف M9 إلى الشريحة. بمجرد نقل الديدان برفق ، قم بإسقاط زلة الغطاء المتقاطعة عليها بحيث ينزلق الغطاء على حافة واحدة. ثم اضغط برفق على زلة الغطاء دون القيام بأي حركات جانبية.

الآن انقل الشريحة على الفور إلى الكتلة المعدنية في النيتروجين السائل واتركها تتجمد. بعد خمس دقائق ، قم بإخراج زلة الغطاء باستخدام الحافة المتدلية. افعل ذلك بسرعة للحصول على الكراك المناسب للبشرة.

بعد ذلك ، اغمر الشريحة في وعاء زجاجي مملوء بالميثانول عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد خمس دقائق ، انقل الشريحة إلى وعاء كوبلن زجاجي مملوء بالأسيتون لمدة خمس دقائق أخرى بنفس درجة الحرارة. يمكن تلطيخ الشرائح مباشرة أو تخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.

قم بإزالة الشريحة من الأسيتون واتركها تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، حدد موقع جدار دائري من الفازلين على الجانب السفلي من الشريحة ، ثم قم ببناء جدار الهلام. لا تفرك الهلام أثناء هذا الإجراء.

بعد ذلك ، قم بإعداد غرفة مبللة في صندوق به مناشف ورقية مبللة وضع الشريحة على رف بداخلها. يجب ألا يكون هناك اتصال بين المناشف والشريحة أو بين الشرائح المجاورة. الآن ماصة كافية PBS في دائرة الهلام لتغطية المنطقة.

ضع طرف الماصة برفق على حافة الدائرة واترك السائل يتشتت بسلاسة فوق الديدان. ثم أغلق الغطاء وانتظر خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، قم بإمالة الشريحة وشفط PBS ببطء مع الحرص على عدم فقدان الديدان من الشريحة.

بعد ذلك ، املأ دائرة الهلام بعناية بمحلول حجب طازج. واترك الشريحة تحتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 15 دقيقة ، استبدل محلول الحجب بمحلول مانع يحتوي على الجسم المضاد الأساسي.

واحتضان الشريحة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي وغسل الشريحة عن طريق تطبيق وإزالة محلول مانع ثلاث مرات. اسمح لكل تطبيق كتلة بالاحتضان لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد الثانوي المخفف في محلول المنع واحتضان الشريحة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل الشريحة مرتين بمحلول مانع ثم مرة واحدة باستخدام PBS. ثم قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBS دون السماح للعينة بالجفاف وإزالة الهلام حول العينة بعناية.

ضع قطرة من وسط التثبيت على العينة متبوعة بزلة غطاء وختم طلاء الأظافر. ثم قم بتخزين الشرائح في الظلام عند أربع درجات مئوية. انقل لوحة مكتبة RNAi من 80 درجة مئوية تحت الصفر إلى الثلج الجاف.

قم بإزالة شريط الختم. ونقل استنساخ الاهتمام إلى مثقاب انتقائي. ثم قم بإخراج الاستنساخ وتنمية البكتيريا طوال الليل.

قبل إعادة لوحة المكتبة إلى الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر ، قم بتطبيق شريط مانع للتسرب جديد. في اليوم التالي ، قم بتلقيح المستعمرات من اللوحة إلى مليلتر واحد من الوسط السائل الذي يحتوي على الأمبيسلين. ثم رجهم لمدة 14 ساعة عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، قم بزرع 200 ميكرولتر لكل استنساخ على ألواح RNAi منفصلة. دع الألواح تجف وتحفز إنتاج الحمض النووي الريبي من خلال حضانة ليلية في درجة حرارة الغرفة. بعد يوم واحد ، انقل خمس ديدان من مرحلة L4 إلى كل لوحة RNAi مصنفة بالجين المحدد المستهدف.

ثم انقل الألواح إلى حاضنة عادة عند 20 درجة مئوية. قم أولا بفحص التحكم مقابل الحمض النووي الريبي تحت الضوء الساطع عند التكبير المنخفض والمرتفع. بعد ذلك ، افحص التحكم مقابل الحمض النووي الريبي تحت ضوء الفلورسنت تحت المرشحات المناسبة.

قم بمسح لوحة تحتوي على الحمض النووي الريبي بشكل منهجي من أعلى اليسار إلى أسفل يمين اللوحة بأكملها بحثا عن الأنماط الظاهرية. ابحث عن ذات الأهمية. لفحص دقيق للأنماط الظاهرية للحمض النووي الريبي المختارة ، ركز على الأمعاء واستخدم التكبير / التصغير لتقييم تكوين الأنابيب والأنماط الظاهرية لتكوين التجويف.

لفحص الديدان ذات الأهمية تحت الفحص المجهري متحد البؤر ، قم أولا بتثبيتها وتثبيتها يدويا ، قم بعمل دائرة رقيقة من الشحوم الفراغية أو الفازلين على شريحة زجاجية. يجب أن تكون طبقة الشحوم رقيقة ، ولا تزيد سمكها عن 0.1 ملم. بعد ذلك ، أضف حوالي 3.5 ميكرولتر من أزيد الصوديوم 10 ملليمولار في منتصف الدائرة.

ثم اختر الديدان ذات الأهمية بسرعة في المحلول تحت مجهر تشريح قبل أن يجف المحلول. ثم ضع برفق زلة غطاء وصور في غضون 30 دقيقة. استخدم ضغطا خفيفا وتحت المجهر تحقق من أن الديدان لا تطفو في المحلول.

تحت المجهر متحد البؤر ، ابحث عن الديدان تحت طاقة وتركيز منخفضين. ثم استخدم هدف الغمر بالزيت 60 أو 100X لعرض الأمعاء وتصويرها. بعد ذلك ، افحص تحت ضوء الفلورسنت باستخدام القناة المناسبة لتحديد المناطق التي تعرض العيب الخلوي المثير للاهتمام.

تحرك بسرعة لتجنب تبييض الصورة. ثم قم بالتبديل إلى المسح بالليزر وقصر الصورة على الأمعاء عن طريق وضع حدود المسح الضوئي في جانبها الظهري والبطني. التقط سلسلة صور ثم ادمج الصور لاحقا في صورة عرض واحدة.

يصف هذا البروتوكول كيفية التحليل الجزيئي وتشريح التكوين الحيوي للغشاء المستقطب بصريا في أمعاء C.elegans النامية حيث يتزامن تكوين الغشاء القمي والتجويف. يمكن حل مجالات الغشاء القمي والقاعدي الجانبي والوصلات المرتبطة بالغشاء والتجويف المعوي ويمكن فحص علاقتها ببعضها البعض طوال فترة التطور. يمكن تصنيف هذه المكونات الخلوية الفرعية بواسطة الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية أو بروتينات الاندماج الفلوري لوضع العلامات المزدوجة أو الثلاثية كما هو موضح في الورقة المصاحبة.

يمكن مسح عيوب التجويف الإجمالية بسرعة باستخدام مجهر فلوري تشريح. رابط الهيكل الخلوي للأغشية القمية ERM-1 المقترن ب GFP هو علامة معبرا عنها بقوة مفيدة لشاشة RNAi. تم الكشف عن مجموعة من الأشكال الظاهرية والقطبية للتجويف المعوي الجديدة جنبا إلى جنب مع عيوبها الجينية الأساسية عند استخدام هذه العلامة.

ثم تم استخدام صور التكبير الأعلى التي تم الحصول عليها بواسطة المسح بالليزر متحد البؤر لفحص الأنماط الظاهرية بعناية أكبر لفهم العيوب الأساسية بشكل أفضل. يمكن تحديد بعض الأنماط الظاهرية. تم استخدام القياس الكمي لمقارنة هذه العيوب وتتبع تقدمها من خلال التطوير.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية أغشية الأمعاء ومقصورات الأغشية الداخلية عن طريق التلوين المناعي وكيفية تحليل الأنماط الظاهرية للوظيفة RNAi للغشاء المستقطب والتكوين الحيوي للتجويف.