ستيريولوجيكال تقدير عدد الخلايا العصبية تتميز في أسود الدماغ الماوس باستخدام فراكتيوناتور الضوئية ومعدات مجهرية القياسية
سبتمبر 1, 2017
يعرض هذا العمل بروتوكول خطوة بخطوة لتقدير إعداد الخلايا العصبية تتميز ستيريولوجيكال غير متحيزة في أسود الدماغ الماوس باستخدام معدات الفحص المجهري القياسي (أي، مجهر ضوء، يجهز كائن جدول (x, y, z الطائرة)، وبرمجيات المجال العام لتحليل الصور الرقمية.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف التقدير التجسيمي القائم على التصميم لعدد خلايا دوبامين في SN للفأر باستخدام معدات الفحص المجهري القياسية. هذه الطريقة مفيدة لتقدير عدد الخلايا العصبية الدوبامينية في مادة الفأر السوداء لأبحاث مرض باركنسون قبل السريرية باستخدام علم القصير غير المتحيز القائم على التصميم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تحقيقها باستخدام معدات الفحص المجهري القياسية دون الحاجة إلى إعداد استقسام كامل متاح تجاريا.
ستظهر الإجراء لويزا فريز ، فنية من مختبري. ابدأ بوضع دماغ فأر ثابت من بارافورمالدهايد في مصفوفة دماغية وإجراء قطع زائد 0.74 ملم من بريجما. انقل الجزء الذيلي من الدماغ بما في ذلك SN إلى 4٪ PFA في 0.1 مولار وقم بإصلاحه طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي ، استبدل PFA بنسبة 30٪ سكروز في 0.1 مولار PBS واحتضنه لمدة يومين آخرين عند أربع درجات مئوية لحماية العينة بالتبريد. بعد يومين عندما يغرق الدماغ في السكروز ، ضع الأنسجة في Cryomold مملوء بمركب درجة حرارة القطع الأمثل وقم بتجميد الأنسجة ببطء في سائل جاف مبرد بالثلج الأيزوبنتان. استخدم ناظم البرد لقطع أقسام التبريد بحجم 30 ميكرون بشكل متسلسل في المستوى الإكليلي.
ضع علامة على نصف الكرة الأيمن عن طريق ثقب ثقب صغير في المنطقة العلوية من جذع الدماغ. اجمع أربع سلاسل من الأقسام تبدأ من سالب 2.46 ملم من بريجما وتنتهي عند 4.04 ملم من بريجما. انقل كل سلسلة من الأقسام إلى أنبوب مملوء بمادة التبريد وخزنها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.
التقط صورا رقمية لأقسام SN الملطخة كيميائيا مناعيا باستخدام برنامج تصوير مقترن بالمجهر. ابدأ بتحديد التركيب الفعلي وسمك الأقسام في ثلاثة مواقع عد مختارة عشوائيا لكل قسم. انقر أولا فوق عرض الإزاحة العلوية لتحديد الجزء العلوي من القسم.
ثم انقر فوق إيقاف العرض العلوي. بعد ذلك ، انقر فوق عرض الإزاحة السفلية ثم انقر فوق إيقاف العرض السفلي. اكتب سمك القسم.
احسب منطقة الحماية عن طريق طرح ثلاثة ميكرونات من الإزاحة العلوية واكتب النتيجة في مربع الإزاحة العلوي. ثم اطرح ارتفاع 13 ميكرون للتشريح البصري من رقم الإزاحة العلوي واكتب النتيجة في مربع الإزاحة السفلي. حدد المعلمات التالية، الخطوات 14، الحجم 1.00.
حدد الدليل لحفظ الملف. انقر فوق التسلسل لبدء الاستحواذ. بعد الحصول على الصور ، انقر فوق المعالجة وحدد المعلمات التالية ، وجميع المستويات من التسلسل والمونتاج ومربعات السريعة والخياطة مع تداخل الصورة بنسبة 10٪ ابدأ في دمج الصور بالنقر فوق ابدأ.
سيؤدي ذلك إلى إنشاء صور مكدسة للتحليل. للبدء ، افتح الصورة بالنقر فوق ملف وافتحه. قم بتعيين مقياس الصورة باستخدام الأمر تحليل وتعيين المقياس.
من هذه الخطوة ، قم بتغيير الحجم المحدد من وحدات البكسل إلى الميكرون. حدد المكونات الإضافية ثم الشبكة ثم أمر خطوط نوع الشبكة لإدراج شبكة بشكل عشوائي. حدد مربع الإزاحة العشوائي.
حدد حجم مربع واحد داخل الشبكة على أنه 130 ميكرون × 130 ميكرون يساوي 16،900 ميكرون مربع. قم بتغيير نوع الصورة من لون 16 بت إلى لون RGB بالنقر فوق الصورة ثم اكتب ثم لون RGB. حدد موقع المادة السوداء بارس كومباكتا.
قم بتطويق المنطقة باستخدام أداة فرشاة الرسم باستخدام عرض الفرشاة 11. تراجع عن أمر تعيين المقياس بالنقر فوق تحليل ثم تعيين المقياس ثم النقر لإزالة المقياس لحسابه بالبكسل بدلا من الميكرون. التقط لقطة شاشة واحفظ ملف الصورة وافتح الملف الجديد باستخدام ImageJ.
حدد الفرشاة وعرض الفرشاة 25. ضع علامة على كل مربع شبكي يتصل ب SN لوضع التشريح البصري. حدد مربع شبكة واحد يتضمن أجزاء من SN. قم بقياس الزاوية اليسرى العليا من المربع باستخدام المؤشر في ImageJ لتحديد إحداثيات البداية x و y.
حدد قالب جدول البيانات بعنوان موضع التشريح البصري واحسب موضع التشريح البصري. ثم قم بتقدير رقم الخلية باستخدام جدول بيانات حساب عدد الخلايا كما هو موضح في الجزء المكتوب من البروتوكول. تظهر هذه الصورة منخفضة الطاقة جزءا من دماغ الفأر بعد تلطيخ TH للخلايا العصبية الدوبامينية.
يصور التكبير العالي الخلايا العصبية الدوبامين الإيجابية TH. يظهر الجزء الداخلي المنطقة المعبأة في تكبير متزايد. تظهر هذه الصورة سلسلة واحدة من أقسام SN الملطخة TH التي تغطي SN للفأر بالكامل من المنقاري إلى الذيلي.
يتم فصل كل قسم عن القسم المتتالي بمقدار 120 ميكرون. تم تقدير عدد الخلايا العصبية الإيجابية TH في SN للفأر الأيمن والأيسر باستخدام الطريقة الموضحة في هذا الفيديو وباستخدام نظام علم القصير المتاح تجاريا. كما هو موضح هنا ، أدت كلتا الطريقتين إلى تعداد خلايا مماثل ولم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعات البيانات.
لا تنس أن العمل مع بارافورمالدهيد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية مثل القفازات الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تقدير تجسيمي غير متحيز لعدد الخلايا العصبية الدوبامينية في مادة الفأر السوداء باستخدام طريقة الكسر البصري ومعدات الفحص المجهري القياسية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
توضح هذه المقالة بروتوكولاً للتقدير الستيريولوجي غير المتحيز لأعداد الخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء لدى الفئران باستخدام أدوات المجهر القياسية. تهدف هذه الطريقة إلى تسهيل الأبحاث قبل السريرية في مرض باركنسون من خلال توفير نهج موثوق لقياس كمية الخلايا دون الحاجة إلى أنظمة ستيريولوجية متخصصة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- أبحاث مرض باركنسون
خلفية علمية
- تعتبر العصبونات الدوبامينية ضرورية للتحكم الحركي.
- تعد المادة السوداء منطقة رئيسية تتأثر في مرض باركنسون.
- يوفر علم التجسيم غير المتحيز طريقة كمية قوية.
- تجعل معدات المجهر القياسية هذه التقنية متاحة.
الغرض من الدراسة
- وضع بروتوكول خطوة بخطوة للتقدير الكمي للخلايا العصبية.
- استخدام علم التجسيم غير المنحاز القائم على التصميم في نماذج الفئران الحية.
- تمكين الدراسات قبل السريرية التي تبحث في فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية.
الطرق المستخدمة
- المجهرية القياسية بما في ذلك المجهر الضوئي وبرامج تحليل الصور الرقمية.
- المادة السوداء في الفأر كنموذج بيولوجي.
- التثبيت التفصيلي، والحماية من التجمد، وتقطيع أنسجة دماغ الفأر.
- التصوير الرقمي وتقنيات كيميائية نسيجية مناعية محددة.
- قياسات وحسابات دقيقة لتحديد تعداد العصبونات.
النتائج الرئيسية
- تم إثبات التقدير الدقيق للعصبونات الدوبامينية في المادة السوداء (SN).
- أعطت كل من الطرق القياسية والمتقدمة أعداداً متقاربة من العصبونات.
- تركيز مهم على موثوقية الطريقة باستخدام الأدوات القياسية.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الدراسة نهجاً قابلاً للتطبيق لتقدير عدد المجموعات العصبونية في الأبحاث.
- تعزز هذه الدراسة فهم فقدان الخلايا العصبونية في مرض باركنسون.
- تستخدم أدوات متاحة بسهولة، مما يعزز نطاق تطبيقها في دراسات العلوم العصبية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يعد القياس الكمي الدقيق لفقدان العصبونات الدوبامينية في المادة السوداء نقطة نهاية حاسمة في الأبحاث قبل السريرية لمرض باركنسون، وهو ما يوجه بشكل مباشر عملية التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية لاستراتيجيات الحماية العصبية. يتيح هذا البروتوكول إجراء تقدير ستيرولوجي موثوق وغير متحيز باستخدام معدات المجهر القياسية، مما يقلل الاعتماد على أنظمة الستيرولوجيا المتخصصة ويزيد من إمكانية الوصول إليها في سير عمل بيولوجيا الاكتشاف. ومن خلال تقديم بيانات كمية وقابلة للتكرار لعدد الخلايا، تدعم هذه الطريقة الثقة التنبؤية في اختبار فرضيات الأهداف في المراحل المبكرة وقرارات تحديد أولويات مجموعة المشاريع البحثية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال تقديم تقدير كمي غير متحيز لبقاء العصبونات الدوبامينية في النماذج قبل السريرية لمرض باركنسون.
- القيمة التشغيلية: يدعم الحد من المخاطر البيولوجية من خلال علم التجسيم القائم على التصميم الذي يقلل من تحيز المراقب والتباينات التقنية في دراسات التفاعل مع الهدف.
- القيمة التنبؤية: يولد بيانات كمية لتعداد العصبونات تساعد في تقييم فعالية تعديل الهدف وتوجيه قرارات المضي قدماً أو التوقف في مراحل الاكتشاف المبكرة.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تُنتج مخرجات نسيجية كمية ومعيارية مناسبة للتحقق من صحة نتائج الفرز التي تهدف إلى الحفاظ على سلامة العصبونات الدوبامينية.
- قابلية التكرار: توفر قياسات متسقة لتعداد الخلايا عبر المقاطع والحيوانات، مما يدعم توحيد المقايسة لتقييم المركبات في المراحل اللاحقة.
- القابلية للتوسع: متوافقة مع برامج المجهر وتحليل الصور القياسية، مما يتيح اعتماداً أوسع عبر منصات الاكتشاف دون الحاجة إلى أجهزة متخصصة.
الأبحاث الترجمية وقبل السريرية
- الأهمية المرضية: يمثل نموذجاً مباشراً لفقدان العصبونات الدوبامينية في المادة السوداء، وهي سمة مرضية أساسية في مرض باركنسون، مما يعزز الصلاحية الانتقالية.
- الاستمرارية قبل السريرية: يوفر جسراً كمياً من مرحلة الفرز الاستكشافي إلى التحقق قبل السريري عبر تقديم بيانات قابلة للمقارنة مع أنظمة علم التجسيم التجارية.
- التقدم المعدل وفق المخاطر: يتيح اتخاذ قرارات موضوعية قائمة على البيانات بشأن تقدم المركبات بناءً على مقاييس إحصائية قوية لبقاء العصبونات.
تكامل تدفق العمل والمسارات
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار فرضية الهدف مرورا بتحديد المركبات الواعدة وصولاً إلى تقييم الفعالية قبل السريرية، مما يوفر قراءة نسيجية كمية تعزز الفهم الآلي والثقة في الهدف.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال التحديد الكمي لمجموعات الخلايا العصبية الدوبامينية كقراءة وظيفية لتعديل المسارات في النماذج قبل السريرية.
- الفحص: يولد مخرجات قائمة على التصوير الكمي وقابلة للتكرار، مما يتيح مقارنة موثوقة لتأثيرات المركبات على بقاء الخلايا العصبية.
- التحليلات: يوفر بيانات عددية لعد الخلايا وقابلية للمقارنة الإحصائية بين المجموعات التجريبية، مما يسهل مقارنات الظروف بناءً على البيانات.
- الأبحاث الانتقالية: يتماشى مع باثولوجيا مرض باركنسون عن طريق قياس فقدان الخلايا العصبية في منطقة من الدماغ ذات صلة بالمرض، مما يدعم التحقق قبل السريري المتوافق مع المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس لسير عمل معياري ومتاح في علم التجسيم (stereology) يمكن تطبيقه عبر برامج اكتشاف متعددة في علوم الأعصاب دون الحاجة إلى معدات كثيفة رأس المال.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي عبر القياس الكمي الستيريولوجي غير المنحاز والقائم على التصميم.
- القيمة التشغيلية: تعزز قابلية التكرار والتوحيد القياسي بين المختبرات من خلال استخدام أدوات المجهر وتحليل الصور المتاحة على نطاق واسع.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال من خلال إلغاء الحاجة إلى أنظمة ستيريولوجيا متخصصة مع الحفاظ على إمكانية مقارنة البيانات مع المنصات التجارية.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات للمرشحين في المرحلة قبل السريرية بناءً على تقييم المخاطر، وذلك استناداً إلى بيانات كمية ومثبتة نسيجياً حول الحفاظ على الخلايا العصبية الدوبامينية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في علم الأنسجة، والكيمياء النسيجية المناعية، ومبادئ علم المجسمات لضمان دقة تحضير الأنسجة وتحديد المناطق.
- يعتمد على معدات المجهر الآلي المزودة بتحكم في المحور z وبرمجيات دمج الصور لإجراء تحليل منهجي للمقاطع.
- يستلزم توحيد بروتوكولات الصبغ، وسمك المقاطع، وقواعد العد بين الفرق لضمان إمكانية تكرار النتائج في مختلف المواقع.
- قد يتطلب التكيف مع مناطق دماغية أخرى أو أنواع مختلفة من العصبونات إجراء تعديلات على معاملات الصبغ، وحجم الشبكة، وأبعاد المقطع البصري (optical dissector).
- تشمل القيود العملية الاعتماد على جودة المقاطع والحاجة إلى تدريب صارم للحفاظ على دقة العد وتجنب انحياز العينات.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
- القيمة العلمية: يضمن التكرار عبر عدة مقاطع وحيوانات مراعاة التباين البيولوجي والتقني، مما يزيد من الثقة في أن أعداد الخلايا العصبية المرصودة تعكس تأثيرات تجريبية حقيقية وليست مجرد عيوب في أخذ العينات.
- القيمة التشغيلية: تقلل بروتوكولات أخذ العينات المتسقة من التباين بين المشغلين وتدعم التوحيد القياسي عبر المختبرات، وهو أمر ضروري لمشاريع الاكتشاف متعددة المواقع.
