الفيلم الجافة على أساس مقاوم الضوء Biosensor موائع جزيئية الكهروكيميائية منصة: تصنيع الجهاز وإعداد مقايسة على شريحة، ونظام التشغيل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقديم منصة استشعار حيوي للموائع الدقيقة الكهروكيميائية متعددة الاستخدامات تعتمد على تقنية مقاومة الضوء للأغشية الجافة منخفضة التكلفة والقادرة على قياس أنواع مختلفة من التحليلات اعتمادا على المقايسة المرتبطة بالإنزيم الثابت المستخدم لاحقا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال اختبار نقاط الرعاية مثل القياس الكمي للأدوية المختلفة ، مثل المضادات الحيوية ، أو تشخيص أمراض مختلفة مثل السرطان. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن المستشعر الحيوي المقدم هنا يعتمد بشكل أساسي على مواد منخفضة التكلفة وسهل الاستخدام ومتعدد الاستخدامات من حيث تطبيقه.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب إتقان الخطوات المتعلقة بمقاومات صور الفيلم الجاف لأن التعامل يتطلب الكثير من التدريب والممارسة. ستظهر إيفا جريثر ، مساعدة الطالب من مجموعتي ، على تثبيت الفحص والقياس على الرقاقة. للبدء ، قم بقطع ركيزة بوليميد أو PI إلى رقائق مستديرة بحجم ستة بوصات.

ثم ضعي رقاقة PI في فرن على حرارة 120 درجة مئوية ، لمدة ساعة تقريبا لخبز الجفاف. لتنفيذ الخطوة الأولى للطباعة الحجرية الضوئية لعملية الإقلاع ، قم ببرمجة مبرمج الدوران على وقت دوران مدته 30 ثانية عند 3000 دورة في الدقيقة مع تسارع 2000 دورة في الدقيقة في الثانية. ضع رقاقة PI على مبرمج الدوران وقم بإصلاحه باستخدام فراغ.

ثم ابدأ برنامج مبرمج الدوران وقم بتوزيع ملليلترين من المقاومة ، مما يتيح عملية الإقلاع. أخرجي الرقاقة من مبرمج الدوران واخبزي رقاقة PI على طبق ساخن لمدة دقيقتين على حرارة 100 درجة مئوية. اضبط القناع المطلوب لتزيين الأقطاب الكهربائية على رقاقة PI بالعين المجردة وقم بتعريضها إلى 400 مللي جول لكل سنتيمتر مربع من مصابيح الأشعة فوق البنفسجية.

ثم ضع الرقاقة في وعاء مملوء بمطور مطابقة مقاوم على شاكر مداري واتركها تهتز قليلا لمدة دقيقة واحدة. بعد إزالة مقاومة الوصول ، استخدم الدش لشطف رقاقة PI بالماء منزوع الأيونات على مقعد مبلل ، قبل تجفيفها باستخدام الهواء المضغوط. بعد ذلك ، قم بإيداع البلاتين لتكوين الأقطاب الكهربائية باستخدام عملية ترسيب بخار فيزيائية قياسية لإيداع 200 نانومتر من البلاتين على الرقاقة.

بعد وضع الرقاقة في وعاء ، أضف مزيل السكويت المطابق إلى الوعاء وقم بإزالة مقاومة الإقلاع ، مع هز الرقاقة قليلا على شاكر مداري حتى تتم إزالة كل بلاتين الوصول. بعد شطف رقاقة PI وتجفيفها كما كان من قبل ، قم بإجراء الخطوة الحجرية الضوئية الثانية وتنظيف الأقطاب الكهربائية كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بتخميل وسادات التلامس البلاتينية للرقاقة بشريط لاصق حساس للأشعة فوق البنفسجية.

للقيام بذلك ، قم بتقطيع الرقاقة إلى شرائح بعرض خمسة ملليمترات وطول 11 سم وقم بتثبيتها على الرقاقة ، مما يحمي الأجزاء التي لا تترسب بالفضة. بالنسبة للترسيب الفضي ، ضع حماما صوتيا في خزانة الدخان وأدخل وعاءا من محلول الإلكتروليت الفضي في الحمام. اضبط الحمام الصوتي على درجة حرارة الغرفة وقم بإلغاء الطاقة على 10٪ قم بتوصيل التلامس السائب للأقطاب الكهربائية المرجعية بمصدر تيار ثابت.

بعد ذلك ، قم بتوصيل القطب المضاد ، وهو سلك فضي مغمور في محلول المنحل بالكهرباء الفضي ، بالمصدر الحالي ، باستخدام كبلات التوصيل القياسية. اضبط المصدر الحالي على DC وعلى كثافة تيار تبلغ حوالي 4.5 مللي أمبير لكل سنتيمتر مربع ، مما ينتج عنه معدل ترسيب فضي يبلغ حوالي 0.3 ميكرون في الدقيقة. ابدأ الحمام الصوتي واترك المصدر الحالي يعمل لمدة 10 دقائق.

بعد 10 دقائق ، اشطف الرقاقة بالماء منزوع الأيونات. لتنفيذ الخطوة الحجرية الضوئية الثالثة ، قم أولا بقص طبقات مقاومة الضوء للفيلم الجاف بحجم مماثل لتلك الموجودة في الرقاقة. ثبت القناع المطلوب على وحدة التعريض الضوئي وقم بمحاذاة طبقة DFR على القناع باستخدام العين المجردة.

ثم قم بإضاءة المقاومة ب 250 مللي جول لكل سنتيمتر مربع من ضوء الأشعة فوق البنفسجية. قم بإزالة الرقاقة الواقية من المقاوم للضوء وقم بتطوير المقاومة لمدة دقيقتين تقريبا في محلول كربونات الصوديوم 1٪ ، باستخدام حمام صوتي قياسي ، مسخن مسبقا إلى 42 درجة مئوية وإلى قوة صوتية 100٪ لإيقاف التفاعل على الفور ، هز المقاومة لمدة دقيقة واحدة في حمام حمض الهيدروكلوريك بنسبة 1٪ على شاكر مداري. اشطف وجفف كل طبقة DFR كما كان من قبل.

لتصفيح طبقات DFR على ركيزة PI ، ضع رقاقة PI على رقائق علوية شفافة وقم بتثبيتها باستخدام شريط لاصق قياسي. اضبط طبقة DFR للقناة على رقاقة PI تحت المجهر باستخدام هياكل المحاذاة المعنية. بالنسبة للتصفيح ، استخدم آلة تغليف قياسية على الساخن وقم بتسخين اللفة العلوية مسبقا إلى 100 درجة مئوية واللفة السفلية إلى 60 درجة مئوية.

اضبط الضغط على ثلاثة بار بسرعة أمامية تبلغ 0.3 متر في الدقيقة. ضع الرقاقة بطبقة DFR الثابتة في منتصف آلة تغليف وابدأ تشغيلها بحيث يتم دفع DFR من خلال آلة التغليف. كرر الخطوة بعد تدوير الرقاقة بمقدار 180 درجة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الطبقة الواقية من الجانب الأمامي لطبقة قناة DFR عن طريق وضع شريط لاصق قياسي في أحد طرفي DFR وسحبه لأعلى. استخدم موزعا يدويا بأنابيب 0.004 بوصة لتوزيع قطرات صغيرة من البولي تترافلورو إيثيلين المذاب في آبار طبقة العزل. لإغلاق شريحة الموائع الدقيقة ، قم بتصفيح طبقة DFR للغطاء على طبقة القناة كما كان من قبل.

بعد ذلك ، قم بخبز المستشعر الحيوي للموائع الدقيقة عن طريق إزالة جميع الرقائق الواقية أولا على الغطاء وطبقات DFR الخلفية. قطع المستشعرات الحيوية إلى شرائح باستخدام مقص عادي. أخيرا ، قم بمعالجة الرقائق في فرن على حرارة 160 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.

لامتصاص أفيدين في منطقة تجميد القناة ، قم بتوزيع ميكرولترين من محلول أفيدين في مدخل المستشعر الحيوي. للتأكد من أن السائل يستمر في التوقف عند الحاجز خلال فترة الحضانة بأكملها ، قم بتوزيع ميكرولترين من الماء منزوع الأيونات على مخرج الشريحة. احتضن الرقاقة عند 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في وعاء مغلق.

قم بإزالة الكواشف الزائدة من خلال مدخل الرقاقة عن طريق وضع فراغ. بعد ذلك ، اغسل القناة ب 50 ميكرولترا من مخزن الغسيل الموزع على المخرج أثناء تطبيق المكنسة الكهربائية. جفف القناة لمدة 30 ثانية بالفراغ.

قم بسد سطح القناة لمنع الارتباط غير المحدد عن طريق الأنبوب الذي يرأس ميكرولترين من محلول BSA بنسبة 1٪ على المدخل وميكرولترين من الماء منزوع الأيونات على مخرج القناة. احتضان الرقاقة عند 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في حاوية مغلقة قبل إزالة كواشف الوصول وتجفيف القناة كما كان من قبل. بعد ذلك ، قم باحتضان أوليغوس الحمض النووي المسمى بالبيوتين وستة FAM عن طريق توزيع ميكرولترين من تركيز واحد من محلول الحمض النووي على المدخل وميكرولترين من الماء منزوع الأيونات على المخرج.

احتضان الرقاقة عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حاوية مغلقة قبل إزالة كواشف الوصول وتجفيف القناة. لتثبيت الجلوكوز أوكسيديز المسمى ستة أجسام مضادة FAM ، أدخل ميكرولترين من محلول الجسم المضاد إلى المدخل وميكرولترين من الماء منزوع الأيونات إلى مخرج القناة. مرة أخرى ، احتضان الأجسام المضادة المصنفة عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في وعاء مغلق قبل إزالة الكواشف الزائدة.

ضع فاصل PMMA السائل على المستشعر الحيوي وقم بتوصيل المستشعر الحيوي كهربائيا ب potentiostat. حقق التوصيل السائل لمضخة الحقنة بالمستشعر الحيوي باستخدام محول السوائل. ابدأ مضخة الحقنة يدويا باستخدام 0.1 مولار PPS بمعدل تدفق 20 ميكرولتر في الدقيقة.

في قطب العمل مقابل القطب المرجعي على الرقاقة ، قم بتطبيق 30 دورة من الجهد المتناوب 0.8 و 0.05 فولت لمدة خمس ثوان لكل منهما. بعد ذلك ، قم بأكسدة القطب الكهربائي العامل عن طريق تطبيق جهد 0.8 فولت لمدة 60 ثانية. لبدء قراءة إشارة المقايسة ، انتظر حتى تستقر إشارة التيار المقاسة.

أوقف مضخة الحقنة وقم بتبديل الكاشف من 0.1 مولار PPS إلى محلول جلوكوز 40 مللي مولار قبل بدء تشغيل البرنامج في وحدة التحكم في مضخة الحقنة. بعد إيقاف التدفق تلقائيا لمدة دقيقة أو دقيقتين أو خمس دقائق ، ستقوم مضخة الحقنة بإعادة تشغيل التدفق مرة أخرى. راقب ذروة التيارات الناتجة.

يحتوي المستشعر الحيوي الكهروكيميائي على قناة واحدة للموائع الدقيقة مع منطقتين متميزتين مفصولتين بحاجز التوقف الكارهة للماء. منطقة الشلل ، حيث يتم تثبيت الفحص عن طريق الامتصاص البسيط للجزيئات الحيوية والخلية الكهروكيميائية حيث يتم إجراء قراءة الأمبيرومتر للمقايس. بالنسبة للقراءة الأمبيرومترية للمستشعر الحيوي ، يتم استخدام ما يسمى بتقنية إيقاف التدفق.

أولا ، يتم تطبيق تدفق مستمر من جلوكوز ركيزة الإنزيم. بعد استقرار الإشارة ، يتوقف التدفق. خلال مرحلة التوقف ، يتم تحويل الجلوكوز إلى بيروكسيد الهيدروجين ويتراكم في القناة.

من خلال إعادة تشغيل التدفق ، يتم مسح بيروكسيد الهيدروجين من خلال الخلية الكهروكيميائية حيث يتم اكتشافه ، مما يؤدي إلى ذروة حالية. اعتمادا على كمية المادة التحليلية المقيدة ، وبالتالي كمية الجلوكوز أوكسيديز المرتبط ، يختلف ارتفاع الإشارة ، مما ينتج عنه مثال على منحنى المعايرة ، كما هو موضح هنا. بمجرد إتقانه ، يمكن تصنيع المستشعر الحيوي في غضون 10 ساعات تقريبا إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.

في حين أن وقت حضانة الفحص والقراءة يعتمد على الفحص المستخدم ، ولكن عادة ما يمكن تحقيقه في غضون ثلاث ساعات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد حول تصنيع وإعداد فحص الرقاقة وتشغيل أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على مقاومة الضوء للفيلم الجاف الكهروكيميائية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التأكد من اتباع جميع خطوات البروتوكول بدقة وتنفيذها بحذر شديد.

نظرا لأن أداء المستشعر يعتمد بشدة على عملية التصنيع. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو الطب الشخصي الذي يغطي التشخيص في الموقع لأنواع مختلفة من الأمراض والأدوية ، وبالتالي تسهيل العلاج الفردي. لا تنس أن العمل باستخدام محاليل الإلكتروليت الفضية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء نظارات السلامة والقفازات المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.