أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد

الهدف العام من هذا البروتوكول النسيجي والتصويري هو تقديم نظام قوي يحافظ على استantigenity الظهارة والسلامة الهيكلية للجلد ، مما يسمح بالاستغلال الكامل لطرق التصوير متحد البؤر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حيث توجد متطلبات لفحص طبيعة أي نوع من الخلايا داخل بنية أنسجة معقدة ثلاثية الأبعاد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالتقنيات النسيجية القياسية هي أنها قوية وسهلة التنفيذ.

بالإضافة إلى ذلك ، يكمل البروتوكول تماما التحليل ثلاثي الأبعاد في الفحص المجهري متحد البؤر. ابدأ بتقليم الجلد الذي يتم حصاده من المنطقة الإنسية الظهرية للفأر إلى قطع مستطيلة. يجب أن يكون حجم كل قطعة لتناسب الجزء السفلي من القالب المبرد.

هنا عرض مساحة سنتيمتر مربع واحد من الجلد الظهري تتناسب مع 22 ملم × 30 ملم × 20 ملم بالتبريد بعد التثبيت ، ادفع الجلد المغسول إلى أسفل القالب المملوء ب OCT بحيث يكون متدفقا مع القاع. ضع علامة على اتجاه بصيلات الشعر على القالب المبرد ، لأن هذا يحدد اتجاه قص stat بالتبريد.

انقل كتل التبريد إلى صفيحة معدنية في فريزر 80 درجة تحت الصفر لمنع تعويم الأنسجة وخلعها. راقب عملية التجميد للحفاظ على اتجاه الجلد في الجزء السفلي من القالب المبرد ، لأن فقاعات الهواء غير المرئية يمكن أن تتسبب في ارتفاع الجلد إلى سطح القالب المبرد. ابدأ بتثبيت كتلة التبريد المجمدة على مرحلة ناظم البرد مع اتجاه بصيلات الشعر ، كما هو موضح في cryomold على طول مستوى التقسيم.

الضبط الصحيح لاتجاه بصيلات الشعر الدقيق على ناظم التبريد أمرا بالغ الأهمية ، لأن هذه الخطوة تحدد مستوى المقطع الذي يولد شرائح الجلد بطول بصيلات الشعر بالكامل سليمة. استخدم ناظم البرد لقطع قسم 100 ميكرون. أمسك OCT حول قطعة الجلد المضمنة بالملقط وانقل القسم من ناظم البرد إلى مزرعة 100 ملم مملوءة ب PBS.

في درجة حرارة الغرفة ، سوف يذوب PBS OCT ، تاركا شرائح الجلد التي يسهل التعامل معها بالملقط. بعد التقسيم ، استخدم الملقط لنقل أقسام الجلد العائمة إلى بئر صفيحة 12 بئر تحتوي على 2.5 مل من PBS. ابدأ وضع العلامات على الفلورسنت المناعي عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PB أولا ، إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 ملليلتر.

استخدم الملقط بعناية لنقل شرائح الجلد من صفيحة 12 بئر إلى الأنابيب للحجب تأكد من غمر جميع شرائح الجلد بالكامل. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على منشار هزاز عند 10 تذبذبات في الدقيقة أو أقل ، لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

قم بتسمية أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة سعة 1.5 ملليلتر لكل شريحة من الجلد ، وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PB الذي يحتوي على الكمية المناسبة من الجسم المضاد الأولي. بعد ساعة واحدة من الانسداد ، انقل شرائح الجلد إلى الأنابيب المعدة حديثا التي تحتوي على الأجسام المضادة. احتضن الشرائح عند أربع درجات مئوية طوال الليل بسرعة منخفضة على هزاز.

في اليوم التالي ، انقل الشرائح إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر تحتوي على 500 ميكرولتر من PBS واغسلها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على هزاز. بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى أنابيب منفصلة للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مليلتر تحتوي على 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PB مع التركيز المناسب للأجسام المضادة الثانوية و DAPI. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع التأرجح ، إذا رغبت في ذلك ، يمكن تخزين العينات لمدة تصل إلى أربعة أيام عند أربع درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.

قبل التصوير ، انقل شرائح الجلد إلى أنابيب منفصلة للطرد المركزي الدقيق تحتوي على 500 ميكرولتر PBS لغسل الأجسام المضادة الثانوية و DAPI. ثم ضع غطاء 22 مليلتر × 50 مليلتر على خلفية داكنة تحت مجهر تشريح. بعد ذلك ، استخدم ماصة سعة 1,000 ميكرولتر مع قطع نهاية الطرف ، لإضافة قطرة واحدة من الجلسرين بنسبة 100٪ على زلة الغطاء.

انقل شريحة الجلد من أنبوب الطرد المركزي الدقيق إلى قطرة الجلسرين. بعد ذلك ، أثناء النظر من خلال المجهر التشريحي ، استخدم ملقطا مدببا لفك شرائح الجلد الملتفة بعناية عن طريق إقناعها بالعودة إلى شكلها الطبيعي أثناء الطفو في الجلسرين. لا تجبر على استقامة الشريحة بشكل غير طبيعي ، لأن ذلك قد يتسبب في تلف الأنسجة.

بمجرد توجيه طول القسم بالكامل وتسطيحه بشكل صحيح على زلة الغطاء. قم بتركيب الأنسجة على شريحة مجهرية عادية ، ستعمل هذه الخطوة على تصويب شريحة الجلد. قم بتصوير أقسام الجلد المثبتة على الجلسرين خلال اليومين المقبلين.

تظهر هذه الصورة قسما بالتبريد للجلد بسمك 10 ميكرون تم الحصول عليه بشكل كلاسيكي المسمى ب Integrin alpha six و Integrin alpha eight ، لتصور حجرة البشرة وعضلات بيلي الإخراجية على التوالي. تم تصنيف هذا المقطع العرضي للأنسجة ثلاثية الأبعاد بسمك 100 ميكرون بنفس الطريقة. الصورة المعروضة هي الحد الأقصى للإسقاطات لمكدس z كبير.

تتم مقارنة التفاصيل من كلتا الصورتين جنبا إلى جنب هنا ، في الأقسام المجمدة الكلاسيكية ، لم يتم تقسيم معظم بصيلات الشعر التي تم تصورها باستخدام الإنتجرين ألفا ستة على طول الطول بالكامل ، مما يولد بصيلات شعر غير مكتملة في الغالب لكل قسم ، مقارنة بالحوامل الأفقية الكاملة. تم تحديد بصيلات الشعر السليمة وعضلات بيلي السليمة في كل من أقسام التثبيت المنزلي الكلاسيكية والأفقية. تم تحديد قسم واحد للتكرار البيولوجي ، كما هو موضح هنا ، يحتوي قسم الجبل بأكمله على نسبة أعلى من البصيلات السليمة وعضلات بيلي المفصلية.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية التقطيع بالتبريد هذه بسرعات تزيد عن 15 قسما في الدقيقة ، مع تحقيق عينات موجهة بشكل مثالي إذا تم إجراء التركيب بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية معالجة وتحليل المقاطع العرضية للأنسجة السميكة في بيئة ثلاثية الأبعاد.