Name: للواسمات Spermatogonia الزرد بأكملها الخصيتين إبرة مغمورة تبريد فائقة السرعة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: تعلم بروتوكول التجميد الزجاجي للخصيتين الكاملتين في سمك الزرد باستخدام إبرة مغمورة، مما يتيح حفظ الخلايا الجرثومية بفعالية لأغراض زرعها لاحقاً في أبحاث علم الأحياء التناسلي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيده هذه الدراسة الوطنية للبحوث والتنمية والابتكار مكتب لهنغاريا (منحة 116912 ÁH)، مكتب التكلفة (الأغذية والزراعة تكلفة العمل FA1205: أكواجاميتي)، هونجاريكوم ستيبينديوم وبرنامج المنح الدراسية (المنح إلى ZM) والجديد المجرية الوطنية التميز بريدوكتورال زمالة (منحة كرونة إستونية).

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرها "قانون رعاية الحيوان الهنغارية".
1-كاشف إعداد
<ol><li>حلول الأسهم<ol>
<li>إعداد تريهالوسي م 1 بإضافة 0.378 ز من ثنائي هيدرات تريهالوسي إلى 1 مل من مزيج O. dH2جيدا حتى أنه يذوب تماما.</li>
		<li>إعداد السكروز 1 م بإضافة ز 0.342 السكروز إلى 1 مل من مزيج O. dH2جيدا حتى أنه يذوب تماما.</li>
		<li>تحضير 1 م حبيس بإضافة 0.238 ز حبيس إلى 1 مل من مزيج O. dH2جيدا حتى أنه يذوب تماما.</li>
		<li>إعداد 20 ملغ/مل كولاجيناز (290 ش/mg) بإضافة 100 مغ إلى 5 مل من برنامج تلفزيوني. المزيج جيدا حتى يذوب عليه. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. اليكووت ميليلتر 50 إلى 0.2 مل PCR أنابيب وتجميد عند-20 درجة مئوية.</li>
		<li>إعداد التربسين 15 ملغ/مل (~ 10000 U/mg) بإضافة 75 ملغ إلى 5 مل من برنامج تلفزيوني. المزيج جيدا حتى يذوب عليه. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. اليكووت ميليلتر 50 إلى 0.2 مل PCR أنابيب وتجميد عند-20 درجة مئوية.</li>
		<li>إعداد 1 ملغ/مل الدناز أنا (~ 3000 يو/mg) بإضافة 5 ملغ إلى 5 مل من برنامج تلفزيوني. المزيج جيدا حتى يذوب عليه. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. اليكووت ميليلتر 50 إلى 0.2 مل PCR أنابيب وتجميد عند-20 درجة مئوية.</li>
		<li>إعداد 0.4% تريبان الأزرق بإضافة 40 مغ تريبان الأزرق إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. 1 مل الكوة في أنابيب 1.5 مل.</li>
		<li>إعداد 200 مغ/لتر MS-222 (تريكيني الميثان المشبعة بالفلور أوكتين) بإضافة 200 مغ من مرض التصلب العصبي المتعدد-222 إلى 1 لتر من dH2ميكس O. جيدا حتى أنه يذوب تماما. بالإضافة إلى ذلك، المخزن المؤقت حل مرض التصلب العصبي المتعدد-222 مع بيكربونات الصوديوم للرقم الهيدروجيني محايدة من 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حلول التزجيج<ol>
<li>إعداد الموازنة الحل (ES): إعداد 2 مل وفاق بخلط 121.5 ميليلتر من الميثانول (ميوه؛ 1.5 متر)، 220 ميليلتر من البروبيلين غليكول (PG؛ 1.5 متر)، 200 ميليلتر من FBS (10%)، 200 ميليلتر حل الأسهم تريهالوسي (0.1 M)، 50 ميليلتر حبيس حل الأسهم (25 مم) و 1208.5 ميليلتر من L-15 إلى 2 أنبوب مل.</li>
		<li>إعداد الحل التزجيج (مقابل): إعداد 2 مل مقابل بخلط 439 ميليلتر من PG (3 م)، 426 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (لي2حتى؛ م 3)، 200 ميليلتر FBS (10%)، 200 ميليلتر من حل تريهالوسي الأسهم (0.1 M)، 50 ميليلتر من هيبيس الأسهم والحل (25 مم) 685 ميليلتر من L-15 إلى أنبوب 2 مل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حلول للاحترار<ol>
<li>إعداد الحل الاحترار 1 (WS1): تعد 1.5 مل WS1 في أنبوب 2 مل بخلط 150 ميليلتر من FBS (10%)، 450 ميليلتر من محلول السكروز الأسهم (م 3) و 900 ميليلتر من L-15.</li>
		<li>إعداد الحل الاحترار 2 (WS2): تعد 1.5 مل WS2 في أنبوب 2 مل بخلط 150 ميليلتر من FBS (10%)، 150 ميليلتر من محلول السكروز الأسهم (1 م) و 1200 ميليلتر من L-15.</li>
		<li>إعداد الحل الاحترار 3 (WS3): تعد 1.5 مل WS2 في أنبوب 2 مل بخلط 150 ميليلتر FBS (10 في المائة) و 1350 ميليلتر من L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد الحل الهضم: لكل عينة إعداد 500 ميليلتر من الحل الهضم بخلط 50 ميليلتر من حل الأسهم كولاجيناز (2 مغ/مل)، 50 ميليلتر من حل الأسهم التربسين (1.5 ملغ/مل)، 10 ميليلتر من الدناز أنا (20 ميكروغرام/مل) و 390 ميليلتر من L-15 في 2 مل أنبوب.</li>
	<li>الحصول على أدوات تشريح: مقص، ميكروسسيسورس، ملاقط، ملاقط المنحنى، والعلاج بوخز الإبر.</li>
</ol>2-الخصيتين جمع
<ol><li>Euthanize السمك بوضعه في طبق يحتوي على 200 مغ/لتر MS-222 (pH = 7). قبل المتابعة مع التشريح، تأكد من أن الخياشيم توقفت عن التحرك، وأن مالا يقل عن 10 دقيقة مرت منذ تلك اللحظة لضمان الموت بنقص.</li>
	<li>الجاف للأسماك طريق الربت عليه على منشفة ورقية ووضعها على جانبها الظهرية على حصيرة تشريح.<ol>
<li>أولاً قطع زعانف الحوض وصدري لتشريح أسهل.</li>
		<li>أفقياً قص الجلد على بطن السمك بين الزعانف الصدرية وقطع الجلد والعضلات الأساسية على طول البطن حتى الزعنفة الشرجية.</li>
		<li>فتح تجويف الجسم من الأسماك ودبوس الجدار الجسم الأيمن والأيسر إلى حصيرة تشريح مع الإبر. ملاحظة: توجد الخصيتين أعلاه الأجهزة الجهاز الهضمي على كلا جانبي المثانة السباحة (الشكل 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>لمنع التلوث، لا تأخذ بها أجهزة الجهاز الهضمي، ولكن بلطف دفعهم إلى جانب واحد وإزالة الخصية من الجانب الآخر. الخصيتين متصلاً بجدار الجسم حتى إزالتها بعناية وقطع الصفاق يربط طريق ميكروسسيسورس.</li>
	<li>بالإضافة إلى ذلك، من أجل منع التلوث، أولاً تعقيم الخصيتين قبل وضعها في الإيثانول 70% 2 ثانية، والمكان ثم لهم في L-15 على لوحة 96-جيدا على الجليد. ملاحظة: إذا لزم الأمر، الخصيتين نظيفة من الأنسجة الدهنية وكبير الأوعية الدموية تحت ستيريوميكروسكوبي الضبط</li>
</ol>3. فائقة السرعة تبريد أنسجة الخصية
<ol><li>اكتب الإبر مارك مع التسميات المناسبة تبعاً للنموذج وإعداد الموازنة (ES) وحلول التزجيج (مقابل).</li>
	<li>نقل الخصيتين صفيحة جيدا أكبر أو طبق ودبوس ثلاثة الخصيتين (أو أكثر تبعاً لحجم الإبرة) بإبرة الوخز بالإبر معقمة.<ol>
<li>أولاً ضع في الخصية على رأس الملاقط منحنية. ضع نقطة الإبرة في وسط الخصية وسحب بعناية في الخصية نحو الأعلى مع الملاقط.</li>
		<li>بعد ثقب في الخصية، اسحبه برفق صعودا نحو الأعلى من الإبرة. تأكد من الخصيتين مفصولة عن بعضها البعض، وأنها لم تسقط أو الانزلاق إلى أسفل.</li>
		<li>مكان شغل الإبر مع الخصيتين المثبتة في أنبوب 2 مل مع L-15 حتى التزجيج (في ˚C 25؛ التخزين ينبغي أن لا يتجاوز الوقت ح 1). ملاحظة: تعلق الخصيتين في الإبرة ينبغي أن يتم سريعاً إلى منع الخصيتين من الجفاف.</li>
	</ol>
</li>
	<li>نقل الإبرة مع الخصيتين إلى الحل الموازنة واحتضان لمدة 5 دقائق في 25˚C.</li>
	<li>تحويل الإبرة إلى الحل التزجيج واحتضان لمدة 30 ثانية في 25˚C.</li>
	<li>إزالة الإبرة من حل التزجيج، وتستوعب بسرعة ولطف الحل المتبقي من الأنسجة بمنشفة ورقية معقمة. توخي الحذر لتجنب الخصيتين التمسك بمنشفة ورقية أو السقوط.</li>
	<li>بسرعة ضع الإبرة في نيتروجين سائل يوضع في مربع الستايروفوم. ملاحظة: قم بهذه الخطوة بسرعة لتفادي التعرض للأنسجة لبخار النتروجين السائل. استخدام وحدات التخزين المنخفضة من النيتروجين السائل لمنع التلوث عبر العينات.</li>
	<li>الاحتفاظ الإبرة في النتروجين السائل في مربع الستايروفوم مغلقة لمدة 5-10 دقائق.</li>
	<li>بريكول كريوتوبي مل 4.5 فتح وبرنامجه في نفس مربع.</li>
	<li>بعد 5-10 دقيقة، نقل كل إبرة في كريوتوبي منفصلة تحت سطح النتروجين السائل وأغلق كريوتوبي. تنبيه: دائماً استخدام الملابس الواقية (مثل القفازات المعزولة) عند العمل مع النيتروجين السائل كما يمكن أن يؤدي التعرض لقضمة الصقيع الشديد.</li>
	<li>ضع كريوتوبي على عصا معدنية ثم ضعه في علبة cryobank في أسرع وقت ممكن. تخزين العينات في تخزين اسطوانة ديوار حتى استخدامها مرة أخرى.</li>
</ol>4-الاحترار الداخلي
<ol><li>الحارة إبرة كل على حدة. ينبغي أن تكون جميع الحلول الاحترار عند 25 درجة مئوية.</li>
	<li>فصل كريوتوبي من قصب معدنية ويغرق هو في النتروجين السائل المخزنة في مربع الستايروفوم.</li>
	<li>فتح في كريوتوبي في بخار النتروجين السائل (باستخدام الملقط) والإفراج عن الإبرة في النيتروجين السائل.</li>
	<li>نقل الإبرة سريعاً جداً في أول حل الاحترار واحتضان لمدة 1 دقيقة (عند 25 درجة مئوية). تأكد من نقل الإبرة بسرعة لمنع الاحترار في الهواء أثناء النقل.</li>
	<li>تحويل الإبرة إلى الحل الثاني الاحترار واحتضان لمدة 3 دقائق (عند 25 درجة مئوية).</li>
	<li>تحويل الإبرة إلى الحل الثالث الاحترار واحتضان لمدة 5 دقائق (عند 25 درجة مئوية).</li>
	<li>الإفراج عن الخصيتين من الإبرة بانزلاق لهم تخفيضها مع ملاقط منحنية. مكان كل الخصية حرارة منفردة في بئر منفصلة (96-جيدا لوحة) مليئة 250 ميليلتر من L-15 وتستكمل مع 10% FBS. تأكد من أن تتم تسمية الآبار وفقا للعينة. تبقى لوحة جيدا على الجليد حتى تكون درجة حرارة جميع العينات وحتى المزيد من العمل.</li>
</ol>5-الأنسجة الهضم
<ol><li>إعداد 500 ميليلتر من الحل الانفصال لكل عينة في أنابيب منفصلة 2 مل. قم بتسمية هذه الأنابيب وفقا للتعليمات البرمجية العينة. احتضان الحل الانفصال من استعداد لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إضافة حرارة الأنسجة إلى الحل الهضم ومقطعة إلى قطع صغيرة بحركات مالا يقل عن 30 من مقص صغير.</li>
	<li>احتضان قطع الأنسجة على لوحة تهتز لمدة 90 دقيقة في 25 ˚C.</li>
	<li>إيقاف عملية الهضم عن طريق إضافة 400 ميليلتر من L-15 و 100 ميليلتر من FBS (10% FBS v/v). باختصار يهز الحل واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تصفية الحل التي تم الحصول عليها من خلال 50 ميكرون المرشحات في أنبوب 1.5 مل. قم بتسمية الأنابيب تبعاً لذلك.</li>
	<li>الطرد المركزي الحل التي تمت تصفيتها في ز × 200 لمدة 10 دقائق في 25 ˚C.</li>
	<li>بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 20 ميليلتر من L15 تكملة مع 10% FBS. يدوياً يهز الأنبوب حتى يذوب بيليه تماما. ستبقى على تعليق خلية على الجليد أو في 4 ˚C حتى استخدامها مرة أخرى.</li>
</ol>6-استمرارية التقييم وخلية العد
<ol><li>مزيج 5 ميليلتر من تعليق خلية وميليلتر 5 0.4% تريبان الأزرق الحل في أنبوب PCR مسماة مناسب 0.2 مل. في حالة استخدام أحجام مختلفة، تأكد من أن نسبة التخفيف من بقايا 1:1.</li>
	<li>احتضان هذا الوقف لمدة 1 إلى 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية).</li>
	<li>التحقق من صلاحية كل عينة في هيموسيتوميتير تحت المجهر.</li>
	<li>حساب عدد الخلايا الحية (أونستينيد قبل blue تريبان) في حقول 15. حساب إجمالي عدد الخلايا في 20 ميكرون من تعليق خلية. التعليق جاهز الآن لأي تطبيق من المتلقين للمعلومات. ملاحظة: عند تحسين الإجراءات المتعلقة بالأنواع الأخرى مع حجم الجسم أكبر، استخدام أجزاء الخصية من نفس الوزن. استخدام الخصيتين من فرد واحد لجميع المجموعات التجريبية بغية تجنب تقلب الفردية في النتائج. في حالة الزرد، ونحن قد استفادت الحقيقة أن اليسار والخصية اليمنى ينبغي أن تحتوي على عدد متساو (أو مشابهة جداً) من الخلايا الجرثومية13 (انظر نتائج الممثل). أبقى في الخصية اليسرى كعنصر تحكم بينما الشركة إنتاج/ارتفعت درجة حرارة الخصية اليمنى. تم حساب النسبة المئوية لبقاء عدد الخلايا المعزولة من الخصية الشركة إنتاج/تحسنت مقارنة بعدد الخلايا المعزولة من الخصية الطازجة.</li>
</ol>

<ol><li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research%3A+Importance%2C+impact%2C+status%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li>
<li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li>
<li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li>
<li>Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N%2CN-dimethylacetamide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li>
<li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogonial+transplantation+in+fish%3A+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+Part+D%3A+Genomics+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li>
<li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li>
<li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress%2C+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li>
<li>Kása, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+%28Eurasian+perch%2C+Perca+fluviatilis%29+and+marine+fish+%28European+eel%2C+Anguilla+anguilla%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li>
<li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li>
<li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+needle+immersed+vitrification%3A+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li>
<li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124(2013).</li>
<li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology%2C+viability%2C+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anim.+Reprod.+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li>
<li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+%28Brachymystax+lenok%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li>
<li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li>
<li>Lujić, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li>
<li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22CryoLetters%22%5BJournal%5D)">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li>
<li>Marinović, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li>
<li>Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells%2C+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li>
<li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nati.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي تبريد فائقة السرعة لأنواع الطيور والثدييات10،11،12 إلى تجميد الأسماك الخصية (الزرد كنموذج الكائن الحي). معظم الدراسات السابقة فيما يتعلق بتجميد الموارد الوراثية الزرد كانت تركز أساسا على تجميد الزرد الحيوانات المنوية2،،من34. ومع ذلك، لم توضع البروتوكولات لتجميد بويضات ناض...

الاتجاهات الجديدة في مجال العلم والتكنولوجيا الحيوية أدت إلى خلق آلاف خطوط جديدة متحولة من الفئران و المورفولوجية، الزرد وغيرها من الأنواع التي تستخدم كنموذج الكائنات الحية في الطب الحيوي و العلوم الأخرى1. وعلاوة على ذلك، كما يتم تطوير التكنولوجيات الجديدة وتصبح متاحة، أرقام الأسطر متحولة اطراد زيادة2. وهذا يؤدي إلى ضرورة لتخزين آمنة للموارد الجينية خارج الممارسات المشتركة للحفاظ على تكاثر المستعمرات. للواسمات كأسلوب التي يمكن تخزينها في مكان أمن للموارد الجينية لفترة غير محددة من الوقت، يوفر مزايا عديدة مثل تمديد الموسم الإنجابية، تلتف الحاجة إلى صيانة مستمرة للأمهات، وهو أكثر تكلفة--و 2من كفاءة العمل.
بروتوكولات لتجميد الحيوانات المنوية خلال مدى عدة سنوات2،3،4 فرصة لنجاح تخزين المواد الوراثية الذكور الزرد. ومع ذلك، نعد من البيض أو الأجنة في الأسماك لم يتم ممكناً بفضل بنيتها المعقدة وكميات كبيرة من مادة الصفار. في الآونة الأخيرة، يقدم ممارسة زرع الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) أو الخلايا الجذعية سبيرماتوجونيال (SSCs) تجاوز لهذا الحاجز بتطوير وظيفي الحيوانات المنوية والبيض بعد زرع5. ولذلك، يقدم للواسمات SSCs أفقاً جديداً في حفظ الموارد الوراثية النادرة والقيمة.
على الرغم من أن نعد يوفر العديد من المزايا، بمعدل بطيء عملية تجميد يولد العديد من الشروط التي قد تؤدي إلى تلف الخلية2. وهذه تشمل تشكيل الجليد داخل الخلية وخارج الخلية، والجفاف، وسمية كريوبروتيكتانت وغيرها. أضرار الجليد داخل الخلية الخلايا، والجليد خارج الخلية قد يؤدي إلى سحق الميكانيكية للخلايا، في حين نشر المياه من الخلايا خلال معدل بطيء التجميد قد يؤدي إلى الجفاف6. في الآونة الأخيرة، تم تطبيق التزجيج كأسلوب الذي يمنع الآثار السلبية لتشكيل الجليد في تجميد الأسماك الأمشاج7،،من89. وهو يقدم أسلوب تبريد سريع جداً من خلالها تتحول وسائل الإعلام الداخلية والخارجية لدولة غير متبلور/زجاجي دون كريستاليزينج في الجليد7،10. وقد تجلى التزجيج ناجحة من أنسجة الخصية والمبيض في أنواع الطيور والثدييات10،11،12، مما فتح إمكانيات لتطبيقه في الأسماك، وكذلك.
في هذه الدراسة، نقدم الإجراء التزجيج (يقول:) إبرة مغمورة لنعد الخصيتين الزرد كله. علينا أن نظهر طريقة موثوقة لعزل الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة الزرد دون التلوث وعملية تجميد أن ينتج كميات عالية نسبيا من الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة مع وجود انخفاض للخلايا الأخرى، لا سيما من المني. على حد علمنا، هذا هو أول دراسة لإثبات بروتوكول تصور مفصل للتبريد السريع جداً للأسماك جوندال الأنسجة والخلايا germline الزرد. بالإضافة إلى ذلك، يظهر التكرار للأسلوب في خمس سلالات مختلفة الزرد: AB البرية نوع، كاسبر (روي--/--؛ الصدف-/-،) ليوبارد (ليوt1/t1) وفأسا [تيراغرام (vas::eGFP)] و Wilms الورم [تيراغرام (wt1b::eGFP 1)] خط المحورة وراثيا.

<table><tbody><tr><td>وسائط Leibovitz (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>مكمل بمصل بقري الجنين L-glutamine</td></tr><tr><td>(FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>تريهالوز</td><td>أكروس أورجانيكس</td><td>99-20-7</td><td>ثنائي هيدرات</td></tr><tr><td>ميثانول</td><td>رينال</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>بروبيلين جلايكول</td><td>رينال</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي ميثيل سلفوكسيد</td><td>الأرانال</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>كولاجيناز</td><td>جيبكو</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>تربسين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن للفوسبات (PBS)</td>أقراص <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>لتحضير محلول 200 مل PBS</td></tr></tbody></table>

للواسمات spermatogonia الزرد بأكملها الخصيتين إبرة مغمورة تبريد فائقة السرعة

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

الاتجاهات الحالية في مجال العلم والتكنولوجيا الحيوية يؤدي إلى خلق الآلاف من خطوط جديدة في نموذج الكائنات الحية مما يؤدي إلى ضرورة اتباع أساليب جديدة للتخزين الأمن للموارد الجينية خارج الممارسات المشتركة للحفاظ على تكاثر المستعمرات. وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي التزجيج (يقول:) كريوبريسيرفي الخصيتين الزرد كله. تجميد الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة من الخصيتين كله يقول: يوفر إمكانيات لتخزين الزرد الموارد الجينية، وخصوصا بعد زرع الأعضاء أنهم يمكن أن تنضج في الأمشاج الذكور والإناث على حد سواء. وقد اقتطعت الخصيتين، معلقة على إبرة الوخز بالإبر، اكويليبراتيد في اثنين من وسائط الإعلام كريوبروتيكتيفي (الحل الموازنة التي تحتوي على الميثانول 1.5 متر و 1.5 متر البروبيلين غليكول؛ والحل التزجيج المحتوية على م 3 ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 3 م البروبيلين غليكول) وانخفضت إلى النيتروجين السائل. وقد استعد عينات في سلسلة من ثلاثة حلول الاحترار ما يترتب عليها. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي (1) عدم وجود المني بعد الهضم من حرارة الخصيتين مما يسهل التلاعب المتلقين للمعلومات؛ (2) فائقة السرعة التبريد تمكين الأمثل تعرض الأنسجة للنتروجين السائل ولتعظيم التبريد وخفض تركيز المطلوبة المنتجة، مما يقلل من سميتها؛ (3) متزامن تعرض الخصيتين عدة للمنتجة والنتروجين السائل؛ والتكرار (4) يتبين من الحصول على صلاحية فوق 50 في المائة في خمس سلالات مختلفة الزرد.

في المتوسط، وعدد الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة معزولة عن الخصية الزرد طازجة واحدة تراوحت بين الخلايا 40,000 و 200 ألف حسب حجم الأسماك. عند هضم الخصيتين الزرد الطازجة في جميع سلالات 5، الخلايا الجرثومية المبكر لم تكن الخلايا فقط موجودة في تعليق خلية (الشكل 2). بجوار الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة، والمنى عديدة عثر كذلك. من ناحية أخرى، كان هناك أقل بكثير المني بعد هضم cryopreserved الخصيتين. وأشار هذا إلى أن المني لا ينجون من هذا البروتوكول تبريد فائقة الس...

وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي التزجيج (يقول:) كريوبريسيرفي الخصيتين الزرد كله. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار التكرار الأسلوب في خمس سلالات مختلفة الزرد.

للواسمات Spermatogonia الزرد بأكملها الخصيتين إبرة مغمورة تبريد فائقة السرعة

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

يوفر الحفظ بالتجميد إمكانية الحفاظ على الخلايا والأنسجة الحية في درجات حرارة منخفضة لفترة زمنية غير محدودة، على الأقل بالمعايير البشرية. والتزجيج هو شكل من أشكال الحفظ بالتجميد يتضمن تبريداً فائق السرعة وصولاً إلى حالة زجاجية غير متبلورة دون تكوين بلورات جليدية ودون الأضرار المرتبطة بذلك. نقدم في هذا الفيديو البروتوكول الخاص بتزجيج خصيتي سمكة الزيبرا الكاملة، مما يسمح بتخزينها بشكل آمن لحين استخدامها لاحقاً كمصدر للخلايا الجرثومية لزراعتها في مستقبلين مناسبين.يتميز بروتوكول التزجيج الحالي بميزة جوهرية واحدة عن بروتوكولات التجميد البطيء فيما يتعلق بمعالجات الخلايا الجذعية الجرثومية؛ وهي أنه بعد عملية التزجيج والإذابة، تموت الحيوانات المنوية ويتم التخلص منها بحيث لا تعود موجودة في المعلق الخلوي. وبناءً على ذلك، لا توجد حاجة لعزل الخلايا الجرثومية بعد الإذابة.وهذا يسهل المعالجات اللاحقة بشكل سريع. قم بقتل السمكة عن طريق وضعها في وعاء يحتوي على 200 milligrams per liter من MS-222 عند pH 7. وقبل البدء في عملية التشريح، تأكد من توقف حركة الخياشيم، ومرور 10 minutes على الأقل منذ تلك اللحظة لضمان حدوث الوفاة بسبب نقص الأكسجة.جفف السمكة عن طريق التربيت عليها بمنشفة ورقية، ثم ضعها على جانبها الظهري فوق حصيرة التشريح. أولاً، قم بقص الزعانف الحوضية والصدرية لتسهيل عملية التشريح. ثم قم بعمل شق أفقي في الجلد على بطن السمكة بين الزعانف الصدرية، واقطع الجلد والعضلات الكامنة أسفله على طول البطن وصولاً إلى الزعنفة الشرجية.افتح تجويف جسم السمكة وثبّت جدار الجسم الأيسر والأيمن على بساط التشريح باستخدام الدبابيس. تقع الخصيتان فوق الأعضاء الهضمية على جانبي مثانة العوم. ولمنع التلوث، لا تخرج الأعضاء الهضمية، بل ادفعها برفق إلى جانب واحد وقم بإزالة الخصيتين من الجانب المقابل.ترتبط الخصيتان بجدار الجسم، لذا يجب إزالتهما بعناية وقطع البريتون الواصل بينهما باستخدام مقصات جراحية دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، ومن أجل منع التلوث، يتم تعقيم الخصيتين أولاً بوضعهما في ethanol 70% لمدة ثانيتين، ثم يتم وضعهما في L-15 على لوحة ذات 96 بئراً فوق الثلج. قم بوضع علامات على الإبر باستخدام الملصقات المناسبة حسب نوع العينة، وجهّز محاليل الموازنة والتزجيج.انقل الخصى إلى طبق أو لوح ذي آبار أكبر، وثبّت ثلاث خصى أو أكثر، اعتماداً على حجم الإبرة، على إبرة وخز صينية معقمة. أولاً، ضع الخصى فوق ملاقط منحنية. ضع طرف الإبرة في منتصف الخصية، ثم اسحب الخصية للأعلى بعناية باستخدام الملاقط.بعد ثقب الخصية، اسحبها بلطف نحو الأعلى باتجاه قمة الإبرة. تأكد من انفصال الخصيتين عن بعضهما البعض وعدم سقوطهما أو انزلاقهما للأسفل. ضع الإبر المثبتة بها الخصى في أنبوب Eppendorf Tubulator مملوء بوسط L-15 حتى تبدأ عملية التزجيج عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.يجب ألا تتجاوز مدة التخزين ساعة واحدة. انقل الإبرة التي تحتوي على الخصيتين إلى محلول الموازنة واحضنها لمدة خمس دقائق عند 25 درجة. ثم انقل الإبرة إلى محلول التزجيج واحضنها لمدة 30 ثانية عند 25 درجة.أخرج الإبرة من محلول التزجيج. قم بامتصاص المحلول المتبقي من النسيج بسرعة وبلطف باستخدام منشفة ورقية معقمة. توخَّ الحذر لتجنب التصاق الخصيتين بالمنشفة الورقية أو سقوطهما.ضع الإبرة بسرعة في نيتروجين سائل داخل صندوق من الفلين. اترك الإبرة في النيتروجين السائل داخل صندوق الفلين المغلق لمدة تتراوح بين 5 إلى 10 دقائق. قم بتبريد أنبوب حفظ تجميدي (cryotube) مفتوح سعة 4.5 milliliter وغطائه في الصندوق ذاته.بعد مرور خمس إلى 10 دقائق، انقل كل إبرة إلى أنبوب تجميد منفصل تحت سطح النيتروجين السائل وأغلق أنبوب التجميد. ضع أنبوب التجميد على حامل معدني ثم ضعه في حاوية بنك التجميد بأسرع ما يمكن. تُخزن العينات في درج تخزين الحاوية حتى وقت الاستخدام.قم بتدفئة كل إبرة على حدة. يجب أن تكون جميع محاليل التدفئة عند 25 درجة. افصل أنبوب التجميد (cryotube) عن القضيب المعدني ثم اغمره في النيتروجين السائل المخزن في صندوق من البوليسترين.افتح أنبوب التجميد (cryotube) في بخار النيتروجين السائل باستخدام ملقط، ثم حرر الإبرة داخل النيتروجين السائل. انقل الإبرة بسرعة كبيرة إلى محلول التدفئة الأول واتركها للحضانة لمدة دقيقة واحدة. تأكد من نقل الإبرة بسرعة لمنع ارتفاع درجة حرارتها في الهواء أثناء عملية النقل.انقل الإبرة إلى محلول التدفئة الثاني، وحضنها لمدة ثلاث دقائق. ثم انقل الإبرة إلى محلول التدفئة الثالث وحضنها لمدة خمس دقائق. حرر الخصيتين من الإبرة عن طريق سحبهما للأسفل باستخدام ملاقط منحنية.ضع كل خصية مُدفأة على حدة في بئر منفصل مملوء بـ 250 µL من وسط L-15، المكمل بنسبة 10% FPS. تأكد من تسمية الآبار وفقاً للعينة. احتفظ بصفيحة الآبار على الثلج حتى يتم تدفئة جميع العينات، وإلى حين استكمال العمل.قم بتحضير 500 µL من محلول التفكيك لكل عينة في أنابيب منفصلة سعة 2 mL. ضع ملصقات على الأنابيب وفقاً لكود العينة. قم بتحضين محلول التفكيك المُحضّر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.أضف النسيج المُدفأ إلى محلول الهضم، وقطعه إلى قطع صغيرة باستخدام مقص صغير في 30 حركة على الأقل. قم بحضن النسيج على لوحة هزازة لمدة 90 دقيقة عند 24 درجة. أوقف عملية الهضم بإضافة 400 µL من L-15 و 100 µL من 10%FPS.رج المحلول لفترة وجيزة ثم حضنه لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بترشيح المحلول الناتج عبر مرشحات 50 ميكرون في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. ضع الملصقات التعريفية على الأنابيب وفقاً لذلك.قم بطرد المحلول المُرشح مركزياً عند 200 G لمدة 10 دقائق عند 25 درجة. قم بإزالة السائل الطافي بعناية وأعد تعليق الراسب في 20 microliters من L-15، المدعم بـ 10%FPS. رج الأنبوب يدوياً حتى يذوب الراسب تماماً.احتفظ بمعلق الخلايا على الثلج أو في درجة حرارة 4 °C حتى حين استخدامه. امزج 5 µL من معلق الخلايا مع 5 µL من محلول trypan blue بتركيز 0.4% في أنبوب PCR سعة 0.2 mL مصنف بشكل مناسب. في حال استخدام أحجام مختلفة، تأكد من بقاء نسبة التخفيف واحد إلى واحد.قم بحضن هذا المعلق لمدة تتراوح من دقيقة إلى ثلاث دقائق عند 25 درجة. افحص حيوية كل عينة في مقياس كرات الدم (hemocytometer) تحت المجهر. قم بعدّ الخلايا الحية التي لم تصبغ بصبغة trypan blue في 15 مجالاً.احسب العدد الإجمالي للخلايا في 20 µL من معلق الخلايا. أصبح المعلق الآن جاهزاً لأي تطبيق لاحق. وفي المتوسط، يتراوح عدد الخلايا الجرثومية في المرحلة المبكرة التي يتم عزلها من خصية واحدة طازجة لسمكة الزيبرا بين 40,000 و200,000 خلية، وذلك اعتماداً على حجم السمكة.في جميع سلالات سمك الزرد المستخدمة في هذه الدراسة، حقق بروتوكول التزجيج الحالي متوسط معدلات بقاء بلغت 50% أو أكثر. ويشير ذلك إلى قابلية بقاء ملائمة وقابلية لتكرار البروتوكول المعروض. وعند هضم خصى سمك الزرد الطازجة في جميع السلالات الخمس، وُجدت أعداد كبيرة من الحيوانات المنوية بالإضافة إلى الخلايا الجرثومية في مراحلها المبكرة.بعد هضم الخصيتين المحفوظتين بالتبريد، تبين وجود عدد أقل بكثير من الحيوانات المنوية، مما يشير إلى أنها لا تنجو من بروتوكول التزجج هذا، ومن المرجح أنها تُفقد أثناء عملية الهضم. يوفر بروتوكول التزجج باستخدام الإبرة المعروض في هذه الدراسة عدة مزايا في الحفظ بالتجميد لقطع الخصية. أولاً، يمكن تثبيت عدة قطع على إبرة واحدة، وبالتالي يمكن تعريضها في آن واحد للمواد الواقية من التجمد وللنيتروجين السائل.علاوة على ذلك، تتيح هذه الطريقة استخدام كميات منخفضة جداً من المواد الواقية من التجميد المرتبطة بقطع الأنسجة. وبالتالي، يمكن أن تكون معدلات التبريد والتدفئة أعلى. وتتمثل إحدى المزايا الهامة في أن الحيوانات المنوية لا تنجو من هذا البروتوكول، وبالتالي تكون معلقات الخلايا في النهاية غنية بالخلايا الجرثومية النطفية، مما يسهل التطبيقات اللاحقة.ولكن، يجب مراعاة إمكانية حدوث تلوث خلطي عن طريق النيتروجين. لذلك، عند استخدام هذه الطريقة، يجب عدم إعادة استخدام النيتروجين السائل.

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا هو الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية عالية الإنتاجية بروتوكول للالزرد. cryopreserved الحيوانات المنوية باستخدام هذا البروتوكول يبلغ متوسط ​​الخصوبة بنسبة 25 ٪ في التلقيح الصناعي لاحقة ومستقرة على مدى سنوات عديدة.

أسلوب الإنتاجية العالية للحصول على الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد واسماك الزرد في المختبر التسميد

هذا هو أسلوب لتوليد اجنة gynogenetic الزرد مضاعفا (الأجنة التي الوراثية فقط المساهمة يأتي من الأم) من خلال منع الانتصافي الدرجة الثانية مباشرة بعد التسميد مع الحيوانات المنوية للضوء فوق البنفسجي المعطل. EP الأجنة ليست متماثلة اللواقح تماما بسبب إعادة التركيب خلال تقسيم الانتصافي الأولى ، ومع ذلك فهي متماثل في جميع مواضع التي لم يتم فصلها عن السنترومير من خلال إعادة التركيب.

جعل Gynogenetic اسماك الزرد ضعفاني بواسطة الضغط المبكر

في هذا الفيديو ، نصف إجراء تزجيج أجنة الأرانب المحصودة في مرحلة التطور المرغوبة باستخدام جلايكول الإيثيلين وثنائي ميثيل سلفوكسيد كمواد تبريد والقش المبرد كنظام ناقل. تتمتع الأجنة المزججة بمعدل بقاء مرتفع ويمكن تخزينها لفترة طويلة حتى الاستخدام.

تزجيج أجنة الأرانب باستخدام القش المبرد: تقنية تبريد فائقة السرعة للحفاظ على أجنة الأرانب للتخزين طويل الأمد

يعتبر سمك الزرد نظاما نموذجيا قويا لعلم الأحياء التنموي وأبحاث الأمراض البشرية نظرا لتشابهها الجيني مع الفقاريات الأعلى. يصف هذا البروتوكول منهجية لإنشاء أجنة أحادية الصيغة الصبغية يمكن استخدامها لاستراتيجيات الفحص الأمامي لتحديد الطفرات المتنحية في الجينات الضرورية للتطور الجنيني المبكر.

إنتاج فرداني الزرد الأجنة عن طريق<em&gt; في المختبر</em&gt; التسميد

يتوسع استخدام أسماك الزرد لأبحاث القلب والأوعية الدموية نحو البحث عن قلوب البالغين. بالنسبة لهذه التطبيقات ، يعد العزل السريع والبسيط لأنسجة القلب أمرا أساسيا لتجنب تغييرات ما بعد الوفاة والحصول على عدد كاف من العينات. هنا ، نصف طريقة سريعة وقابلة للتكرار لتشريح قلوب أسماك الزرد البالغة.

التعافي من اسماك الزرد الكبار قلوب للتطبيقات عالية الإنتاجية

أخذ عينات الدم المتكررة ضروري ومهم في البحوث على. لقد طورنا طريقة جديدة وغير مميتة وموثوقة لجمع الدم المتكرر من أسماك الزرد البالغة ، وطبقنا هذه الطريقة على دراسة الكيمياء الحيوية للدم ، بما في ذلك استقلاب الجلوكوز.

كرر جمع الدم لاختبارات الدم في اسماك الزرد الكبار

يستخدم بروتوكول تعديل للتلاعب الصيغة الصبغية صدمة الحرارة للحث على المماطلة دورة واحدة في الانقسام السيتوبلازمي في الجنين في وقت مبكر. ويتجلى هذا البروتوكول في الزرد ولكن قد تكون قابلة للتطبيق على الأنواع الأخرى.

التلاعب الصيغة الصبغية من الزرد الأجنة مع الحرارة صدمة 2 العلاج

هنا ، نقدم بروتوكولًا للكشف عن الأجسام المضادة الفلورية بوساطة البروتينات في الاستعدادات الكاملة لأجنة ويرقات سمك الحمار الوحشي.

كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات

ينتشر السطح النووي هي أداة لا غنى عنها لدراسة الأحداث الكروموسومية أثناء الداء الميوي. هنا نُظهر طريقة لإعداد وتصور الكروموسومات الميوتيكية خلال المرحلة الأولى من الحيوانات المنوية من سمك حمار وحشي.

إعداد ينتشر كروموسوم Meiotic من الحيوانات المنوية زيبرافيش

هنا، نقدم طريقة بسيطة لفصل الخلايا الجريبية والبويضات في بصيلات المبيض حمار وحشي، والتي سوف تسهل التحقيقات في تطور المبيض في حمار وحشي.

فصل الخلايا الجريبية والبويضات في بصيلات المبيض من حمار وحشي

أحدثت تقنيات كريسبر-كاس ثورة في مجال تحرير الجينوم. ومع ذلك ، فإن العثور على تعديل الخط الجرثومي المطلوب وعزله لا يزال يمثل عنق الزجاجة الرئيسي. لذلك ، يصف هذا البروتوكول طريقة قوية لفحص الحيوانات المنوية لأسماك الزرد المحقونة ب F0 CRISPR بسرعة لإجراء تعديلات على الخط الجرثومي باستخدام تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية وهضم التقييد والرحلان الكهربائي الهلامي.

فحص الحيوانات المنوية للعزل السريع لتعديلات الخط الجرثومي في الزرد

تعلم بروتوكول التجميد الزجاجي للخصيتين الكاملتين في سمك الزرد باستخدام إبرة مغمورة، مما يتيح حفظ الخلايا الجرثومية بفعالية لأغراض زرعها لاحقاً في أبحاث علم الأحياء التناسلي.

للواسمات Spermatogonia الزرد بأكملها الخصيتين إبرة مغمورة تبريد فائقة السرعة

استكشف المزيد من الفيديوهات