استخدام دينسوفيروس المؤتلف البعوض ناقل توصيل جينات للتحليل الوظيفي للجينات في يرقات البعوض

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل الوظيفة الجينية ليرقات البعوض، باستخدام فيروس densovirus المعدل وراثياً كناقل للجينات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في أنظمة التوصيل القائمة على الفيروسات، مثل كيفية التغلب على الحواجز الخلوية واللاخلوية المرتبطة بها. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنيات في سهولة المعالجة، وكفاءة التنبيغ العالية، والاستخدام القوي وطويل الأمد للتعبير الجيني، والقدرة على إحداث تأثيرات مستمرة في الجسم الحي (in vivo).

أثبت هذا العمل أنه يمكن زيادة تعبير جزيئات RNA صغيرة محددة أو جينات مستهدفة، أو تثبيط تعبيرها في يرقات البعوض، باستخدام نظام التوصيل المطور بفيروس densovirus. وتوسع تداعيات هذه التقنية تطبيقات استراتيجية التعبير الموضحة لاستقصاء بيولوجيا البعوض، لأن هذه الطريقة تسمح بإجراء عمليات ترنسدكشن سهلة لليرقات. ستقوم Pei-Wen Liu، المرشحة لنيل درجة الدكتوراه من مختبرنا، بشرح الإجراء.

ابدأ بطلب التخليق الكيميائي لتسلسلات cDNA كاملة الطول لـ miRNAs السليفة، وإسفنجات miRNA، وshRNA، كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق. بعد استلام الحمض النووي DNA المطلوب، قم بتدوير الأنابيب التي تحتوي على كتل DNA لضمان استقرار كل الـ DNA المجفف في قاع الأنبوب. بعد ذلك، أعد تعليق الـ DNA في ماء خالٍ من DNase للوصول إلى تركيز نهائي قدره 10 nanograms per microliter.

أضف 6 µL من XbaI لهضم الهيكل البلازميدي وتسلسلات cDNA، وضع التفاعل عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، قم بإزالة الفوسفات من النهايات الخمسية للهيكل البلازميدي المخطّي باستخدام الفوسفاتاز القلوي من أمعاء العجول، وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. ولضمان كفاءة التعبئة، يجب ألا يتجاوز حجم الجينوم 4,400 nucleotide، وهو ما يمثل 110% من طول جينوم فيروس densovirus للبعوض من النوع البري، أو يمكن إدخال تعبير microRNA إنتروني لا يزيد عن 400 nucleotide في جينوم Aedes aegypti.

بعد ذلك، قم بتعطيل الفوسفاتاز القلوي حرارياً عند 65 °C. ثم، قم بتشغيل الـ DNA على هلام أغاروز بتركيز 1%، واقطع قطعة العمود الفقري الخطي. استخلص الـ DNA من شريحة الهلام باستخدام طقم استخلاص الهلام، مع اتباع تعليمات الشركة المصنعة.

بمجرد استخلاص قطعة الـ DNA، قم بربطها بالعمود الفقري (backbone) باستخدام T4 DNA ligase. بعد ذلك، استخدم الصدمة الحرارية لنقل نواتج تفاعل الربط إلى خلايا E.coli من سلالة DH5-alpha المختصة. ثم قم بنشر البكتيريا المحولة على طبق أغار LB يحتوي على 100 micrograms per milliliter من الأمبيسيلين.

في اليوم التالي، اختر مستعمرة واحدة من الطبق، وقم بإنشاء مزرعة بادئة باستخدام 3 mL من الوسط الغني الذي يحتوي على 100 µg/mL من الأمبيسيلين. وأخيراً، استخلص DNA البلازميد من المزرعة البكتيرية باستخدام طقم miniprep، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. أرسل عينة من DNA إلى شركة لتسلسل DNA للتحقق منها.

قم بربط pre-miRNA أو shRNA في موقع HpaI لمنطقة تشفير NS1 لفيروس AaeDV في الهيكل البلازميدي pUCA، باستخدام الطرق التي تم عرضها لكاسيت تعبير الـ small-RNA الإنتروني الاصطناعي. وبدلاً من استخدام خلايا DH5-alpha، قم بتحويل DNA إلى خلايا E.coli كفؤة من سلالة Stbl3. بعد ذلك، ازرع الخلايا المُحوّلة على طبق أغار LB يحتوي على 100 micrograms per milliliter من الأمبيسيلين، وقم بإعداد مزرعة بادئة من مستنسخ إيجابي. عقب ذلك، استخلص بلازميد rAaeDV من الخلايا البكتيرية باستخدام طقم maxiprep، وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

في اليوم صفر، يتم تقسيم الدوارق التي وصلت فيها خلايا C6/36 إلى درجة تلاقي تتراوح بين 90 إلى 95% بنسبة واحد إلى اثنين في 10 دوارق زراعة من نوع T-25. تُحضن الدوارق لمدة تتراوح بين 18 إلى 20 ساعة عند 28 درجة مئوية حتى تصل مرة أخرى إلى درجة تلاقي تتراوح بين 90 إلى 95%.

في اليوم الأول، يتم ترصيف الخلايا باستخدام بلازميدات rAaeDV المُحضرة. ولتحقيق ذلك، خفف 10 micrograms من الـ DNA في 600 microliters من وسط RPMI-1640، وامزج المحلول برفق. وفي هذه الأثناء، قم بتحضير 600 microliters من وسط RPMI-1640 و25 microliters من كاشف الترصيف لكل عملية ترصيف.

قم بتحضين الخلايا مع الـ DNA لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف 625 µL من خليط كاشف ترانسفكشن RPMI-1640 إلى خليط الـ plasmid DNA، وحضن هذا الخليط لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عقب التحضين، اغسل الخلايا مرتين بوسط RPMI-1640، ثم أضف خليط الترانسفكشن إلى كل من دوارق الزرع T-25.

قم بتحضين الخلايا في مزيج ترانسفكشن لمدة ست ساعات عند 28 درجة Celsius. بعد مرور ست ساعات، أزل وسط الترانسفكشن، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 5 mL من وسط RPMI-1640، ثم أضف وسط RPMI-1640 طازجاً يحتوي على 10% FBS. بعد خمسة أيام من عملية الترانسفكشن، استخدم قطارة زجاجية سعة 5 mL لفصل وتعليق الخلايا في الأطباق عن طريق السحب والضخ باستخدام وسط الزرع.

انقل معلقات الخلايا من كل قارورة إلى أنبوب معقم خاص بها سعة 50-milliliter. ومن أجل حصاد فيروس يعتمد على عتبة عالية، من الضروري الحفاظ على الخلايا لمدة خمسة أيام بعد عملية التعدي (transfection). ثم قم بتجميد الأنابيب الفردية عند درجة حرارة negative 80 degrees Celsius أو في حمام من الثلج الجاف والإيثانول لمدة 30 minutes.

بعد ذلك، قم بإذابتها سريعاً عند 37 درجة مئوية، ثم قم بعمل خلط دوامي (vortex) لمعلق الخلايا لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، اجمع السائل الطافي من العينة التي تم طردها مركزياً، وتخلص من الراسب. ثم، مرر السائل الطافي عبر مرشح حقنة مخصص للاستخدام مرة واحدة بقطر مسامي 0.22 ميكرومتر.

قم بتقسيم مخزونات الفيريونات المُنقاة النهائية إلى حصص (Aliquot) وتخزينها عند درجة حرارة -80 °C. اغسل 100 يرقة من نوع A. albopictus في طورها اليرقي الأول ثلاث مرات، باستخدام ماء منزوع الأيونات. بعد ذلك، انقل اليرقات إلى دورق يحتوي على 95 milliliters من الماء منزوع الأيونات.

أضف خمسة ملليلترات من مخزونات rAaeDV، واحضن اليرقات لمدة 24 ساعة عند 28 درجة مئوية. ولضمان نجاح إصابة اليرقات، من الضروري أن تظل اليرقات محاطة بجزيئات الفيروس المعدي لمدة تتراوح بين 24 إلى 36 ساعة لضمان تحقيق نسب إصابة عالية. بعد فترة التحضين، اغسل اليرقات ثلاث مرات باستخدام الماء منزوع الأيونات، ثم انقل اليرقات مرة أخرى إلى الأطباق. قم بتغذية اليرقات بانتظام. راقب مستوى تعبير الجين المستهدف في اليرقات باستخدام تقنية quantitative PCR أو western blot، باتباع التقنيات القياسية.

في هذا المثال، تم تحليل 100 يرقة في الطور الأول لتقييم تعبير miRNA الداخلي لديها بعد الإصابة بالفيروس المؤتلف الذي يحتوي على كاسيت تعبير aal-let-7، والذي أظهر فرطاً في التعبير.

تظهر كفاءة بنية anti-let-7 على اليمين، مما يسلط الضوء على قدراتها في التثبيط (knockdown). ومن أجل مراقبة كفاءة تثبيط mRNA لـ V-ATPase بواسطة ناقلات rAaeDV، تمت معالجة إجمالي 100 يرقات في الطور الأول بكميات متساوية من rAaeDV بأنواع مختلفة عن طريق إضافة الفيروس إلى الوسط المائي لموطن اليرقات. وقد انخفضت مستويات mRNA لـ V-ATPase بشكل كبير بواسطة rAaeDV المعبر عن miRNA وبواسطة rAaeDV المعبر عن intronic shRNA.

تؤكد نتائجنا فعالية استراتيجية التعبير الإنتروني التي تقدم نموذجاً جديداً يمكنه التغلب على قيود فيروسات الدينسو الخاصة بالبعوض ذات الجينوم المعيب، وذلك لتمكين التوصيل الفعال للجينات الغريبة إلى البعوض. وعند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أنه يمكن إدخال كاسيت تعبير microRNA إنتروني لا يتجاوز 400 nt في جينوم فيروس الدينسو الخاص بـ Aedes aegypti. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث المتعلقة بإنتاج فيروسات دينسو معاد تركيبها وغير معيبة خاصة بالبعوض، والتي يمكنها زيادة تعبير أو خفض تنظيم microRNAs والجينات المستهدفة لاستكشاف التحليل الوظيفي لجينات البعوض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نظام توصيل فيروس دينسوف البعوض المطور لتحليل الوظائف الجينية في يرقات البعوض.