في الموقع تلوين تيترامير MHC والتحليل الكمي تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد موقع ووفرة والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 الموجبة المحددة للمستضد داخل الأنسجة المستهدفة. تساعد هذه الطريقة في الإجابة على تساؤلات سريعة حول الخلايا التائية CD8 من خلال توفير وسيلة لتحديد موقع وكمية والنمط الظاهري لأي خلية تائية CD8 محددة للمستضد تقريباً وفي أي نسيج. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بتحديد التوزيع المكاني للخلايا التائية CD8 الموجبة المحددة للمستضد بالنسبة للخلايا والهياكل الأخرى داخل الأنسجة المستهدفة.

سيقوم Gwantwa Mwakalundwa بتوضيح الإجراء مع Shengbin Li. في اليوم الأول من الإجراء، استخدم المشرط لتقطيع الأنسجة الطازجة إلى قطع يبلغ حجمها حوالي 0.5 x 0.5 centimeter. تظهر هنا أنسجة طحال قرد المكاك الريسوس.

قم بلصق كل قطعة نسيج بشكل منفصل في منتصف الجزء العلوي من المكبس، ثم غمر العينات في ثلاثة إلى خمسة مليلترات من agarose منخفض الانصهار بتركيز 4% الدافئ في PBS. ضع ملصقات على المكابس تتضمن معلومات النسيج ذات الصلة. بعد ذلك، ضع العينات في حامل مبرد داخل دلو ثلج.

عندما يتصلب الآجار، قم بتشغيل الميكروتوم واضبط إعداد السمك على 200 micrometers. بعد تركيب شفرة حلاقة جديدة، أدخل المكبسات في حمام الميكروتوم. املأ حمام الميكروتوم من 100 إلى 200 milliliters من PBS-H المُحضّر حديثاً وأضف مكعبات ثلج من PBS-H للحفاظ على درجة الحرارة بين صفر ودرجتين celsius.

بعد الحصول على مقاطع بسمك 200 micrometer، استخدم فرشاة رسم لإزالة الآجار المحيط بكل مقطع، ثم انقل العينات إلى غرف أنسجة فردية داخل آبار منفصلة في طبق زراعة أنسجة مكون من 24 بئراً يحتوي كل منها على 1 milliliter من PBS-H المبرد. وعند الانتهاء من جمع كافة العينات، يتم تحضين مقاطع الأنسجة طوال الليل في 1 milliliter من MHC class one tetramers المحملة بـ fit conjugated peptide، والمخففة في PBS-H مضاف إليه 2% normal goat serum عند درجة حرارة 4 degree celsius مع الرج المستمر. وفي صباح اليوم التالي، انقل كل غرفة أنسجة إلى آبار فردية في طبق جديد مكون من 24 بئراً يحتوي كل منها على 1 milliliter من PBS-H المبرد والطازج لمدة 20 minutes.

بعد الغسلة الثانية، قم بتثبيت المقاطع في 1 مل من 4% paraformaldehyde طازج لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. يتبع ذلك غسلتان لمدة خمس دقائق في PBS-H بارد. انقل المقاطع إلى طبق جديد يحتوي على 24 بئراً ويحتوي على 0.01 molar urea، وعرض المقاطع للميكروويف ثلاث مرات لمدة 10 ثوانٍ تقريباً في كل مرة حتى يغلي urea.

لنفاذية العينات وحجبها، تُحضن المقاطع في محلول حجب يحتوي على PBS-H مُدعم بمنظف triton x100 بنسبة 0.3% ومصل ماعز طبيعي بنسبة 2% على هزاز لمدة ساعة واحدة، عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. وفي نهاية فترة التحضين، تُنقل غرف الأنسجة إلى آبار فردية في لوحة 24 بئرًا جديدة تحتوي على واحد ملليلتر من محلول يضم جسماً مضاداً للأرنب anti-fitc، وجسماً مضاداً للفأر antihuman CD، وجسماً مضاداً للجرذ antihuman CD3. تُحضن العينات طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية مع الهز.

في اليوم الثالث، تُغسل المقاطع ثلاث مرات في محلول PBS-H طازج عند درجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة على الأقل لكل غسلة، ثم يتم إجراء تحضين نهائي باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المناسبة والمقترنة بفلوروفور لمدة تصل إلى ثلاثة أيام، مع الحماية من الضوء. في نهاية تحضين الجسم المضاد الثالث، تُشطف العينات بثلاث غسلات لمدة 20 دقيقة في محلول PBS-H طازج، وتُستخدم فرشاة رسم لنقل العينات من كل حجرة نسيجية إلى شريحة مجهر زجاجية. تُغطى كل شريحة بوسط تثبيت مدعم بمادة حافظة للفلوروفور، ثم تُغطى العينات بغطاء شريحة.

بعد ذلك، تُحفظ الشرائح في حاوية شرائح محمية من الضوء، عند 20 degrees celsius. وفي يوم التصوير، توضع الشريحة الأولى على منصة مجهر بؤري (confocal microscope) ويتم اختيار الليزرات والمرشحات المناسبة لكل فلوروفور استُخدم لوسم عينة النسيج. وباستخدام العدسة الشيئية 20x، يتم الحصول بالتتابع على سلسلة z بفواصل زمنية قدرها ثلاثة micron في كل قناة من قنوات الفلوروفور، وذلك في عدة حقول تبلغ مساحتها 800 x 800 pixel.

بعد ذلك، قم بإنشاء تجميعة (montage) للحقول التي تم جمعها واحفظ كل صورة تجميعة باسم يعتمد على عينة النسيج المقابلة. وفي هذه الصور التمثيلية، تتم مقارنة مقطع مصبوغ بـ MHC class one tetramers المحملة بـ SIV peptide بمقطع من النسيج نفسه، مصبوغ بـ MHC class one tetramers المحملة بـ irrelevant peptide، مما يثبت خصوصية صبغ الـ tetramer. وفي هذه الصور، تظهر الخلايا التائية النوعية للفيروس المصبوغة بـ MHC class one tetramer المحملة بـ SIV peptide، صبغًا مشتركًا لـ CD8، وهو مؤشر لمجموعة فرعية من الخلايا التائية، ولكن ليس لـ CD20، وهو بروتين على سطح الخلية يُعبر عنه في الخلايا البائية.

تم إنشاء هذا التجميع لعدة حقول من السلاسل المحورية z المكتسبة عبر المجهر البؤري، والتي استُخدمت لتقدير كمية الخلايا المصبوغة بالرباعيات ذات الأنماط الظاهرية المحددة وفي أقسام تشريحية مختلفة في العقدة الليمفاوية. وتبرز هذه الصورة المكبرة منطقة من تجميع العقدة الليمفاوية تحتوي على جريب خلايا B محدد بواسطة صبغ IGM. ويمكن رصد الخلايا المصبوغة برباعيات MHC من الفئة الأولى، والتي يعبر بعضها عن علامة تنشيط وتكاثر الخلايا التائية KI67، داخل جريب خلايا B وخارجه.

تتيح تركيبة الصبغ هذه تحديد حالات التنشيط والتكاثر للخلايا التائية CD8 الموجبة والمحددة لفيروس SIV، بالإضافة إلى تحديد تموضعها داخل الأنسجة اللمفاوية الثانوية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون خمسة أيام تقريبًا إذا نُفذت بشكل صحيح. ومن المهم عند محاولة تطبيق هذا الإجراء تذكر أن الأنسجة الطازجة أمر بالغ الأهمية لضمان نجاح عملية الصبغ.

قم بمعالجة العينات خلال 24 ساعة أو أقل بعد الحصاد، مع الحفاظ عليها مبردة حتى عملية التثبيت. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء صبغ التيتรามير (tetramer staining) والكيمياء النسيجية المناعية لتحديد موقع ووفرة والنمط الظاهري لخلايا T الموجبة لـ CD8 والمحددة للمستضد في الأنسجة المستهدفة. لا تنسَ أن العمل مع العوامل المعدية يمكن أن يكون خطيرًا للغاية، وأنه يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة لمنع التعرض، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والحد من استخدام الأدوات الحادة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.