في الموقع تلوين تيترامير MHC والتحليل الكمي تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد موقع ووفرة ونمط ظاهري للخلايا التائية الإيجابية CD8 الخاصة بالمستضد داخل الأنسجة ذات الأهمية. تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة سريعة حول الخلايا التائية CD8 من خلال توفير وسيلة لتحديد موقع وتحديد وتحديد النمط الظاهري تقريبا لأي خلية CD8 T خاصة بالمستضد وأي نسيج. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحديد التوزيع المكاني للخلايا التائية الإيجابية CD8 الخاصة بالمستضد بالنسبة للخلايا والهياكل الأخرى داخل الأنسجة ذات الأهمية.

وسيكون عرض الإجراء مع Shengbin Li هو Gwantwa Mwakalundwa. في اليوم الأول من الإجراء ، استخدم مشرطا لتقطيع الأنسجة الطازجة إلى قطع 0.5 × 0.5 سم تقريبا. هنا ، يتم عرض أنسجة طحال المكاك الريسوسية.

بلصق كل جزء من الأنسجة بشكل منفصل في منتصف الجزء العلوي من المكبس وقم بتضمين العينات في ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من الاغاروز الدافئ ذوبان 4٪ في PBS. قم بتسمية الغطاسات بمعلومات الأنسجة ذات الصلة. ثم ضع العينات في حامل مبرد في دلو ثلج.

عندما يتجمد الأجار ، قم بتشغيل الميكروتوم واضبط إعداد السماكة على 200 ميكرومتر. بعد تثبيت شفرة حلاقة جديدة ، أدخل الغطاسات في حمام الميكروتوم. املأ الحمام الصغير ب 100 إلى 200 مل من PBS-H المحضر حديثا وأضف مكعبات ثلج PBS-H للحفاظ على درجة الحرارة بين صفر إلى درجتين مئويتين.

بعد الحصول على أقسام 200 ميكرومتر ، استخدم فرشاة الرسم لإزالة الأجار المحيط بكل قسم ونقل العينات إلى غرف الأنسجة الفردية داخل آبار فردية للوحة زراعة أنسجة 24 بئر تحتوي على ملليلتر واحد من PBS-H المبرد. عندما يتم الحصول على جميع العينات ، احتضان أقسام الأنسجة طوال الليل في مليلتر واحد من ربعي الببتيد المترافق المحمل بنظام التوافق النسيجي الكبير من الفئة الأولى ، المخفف في PBS-H المكمل بمصل الماعز العادي بنسبة 2٪ عند أربع درجات مئوية مع الهزاز. في صباح اليوم التالي ، انقل كل غرفة أنسجة إلى آبار فردية من صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا تحتوي على ملليلتر واحد من PBS-H الطازج المبرد لمدة 20 دقيقة.

بعد الغسيل الثاني ، قم بإصلاح الأقسام في مليلتر واحد من 4٪ بارافورمالدهيد الطازج لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. تليها غسلتان لمدة خمس دقائق في PBS-H بارد. انقل الأقسام إلى صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا تحتوي على 0.01 مولي من اليوريا وقم بتسخين الأقسام في الميكروويف ثلاث مرات لمدة 10 ثوان في كل مرة حتى تغلي اليوريا.

لاختراق العينات وسدها ، احتضان الأقسام في محلول الحجب الذي يحتوي على PBS-H مكمل بمنظف 0.3٪ triton x100 و 2٪ مصل ماعز عادي على الروك لمدة ساعة واحدة ، عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، انقل غرف الأنسجة إلى آبار فردية من صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا تحتوي على مليلتر واحد من المحلول الذي يحتوي على جسم مضاد للأرانب المضاد للفيتك ، وجسم مضاد للقرص المضغوط البشري للفأر وجسم مضاد للفئران CD3 المضاد. احتضان العينات طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع الهزاز.

في اليوم الثالث ، اغسل الأقسام ثلاث مرات في PBS-H الطازج عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل لكل غسلة وقم بإجراء حضانة نهائية باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة المناسبة لمدة تصل إلى ثلاثة أيام ، محمية من الضوء. في نهاية حضانة الأجسام المضادة الثلاثية ، اشطف العينات بثلاث غسلات لمدة 20 دقيقة في PBS-H الطازج واستخدم فرشاة طلاء لنقل العينات من كل غرفة أنسجة إلى شريحة مجهر زجاجي. قم بتغطية كل قسم بوسيط تركيب مكمل بمادة حافظة فلوروفور وقم بتغطية العينات بقلة غطاء.

بعد ذلك ، قم بتخزين الشرائح في حاوية منزلقة محمية بالضوء ، عند 20 درجة مئوية. في يوم التصوير ، ضع الشريحة الأولى على مسرح المجهر متحد البؤر وحدد الليزر والمرشحات المناسبة لكل فلوروفور يستخدم لتسمية عينة الأنسجة. باستخدام هدف 20x ، احصل بالتتابع على سلسلة z على فترات ثلاث ميكرون في كل قناة من قنوات الفلوروفور ، في حقول متعددة 800 × 800 بكسل.

بعد ذلك ، قم بإنشاء مونتاج للحقول التي تم جمعها واحفظ كل صورة مونتاج باسم بناء على عينة الأنسجة المقابلة. في هذه الصور التمثيلية ، تتم مقارنة قسم ملطخ برباعيات معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الأولى المحملة بببتيد SIV بقسم من نفس النسيج ، ملطخ برباعي معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الأولى المحملة بببتيد غير ذي صلة ، مما يدل على خصوصية تلطيخ رباعي الوريد. في هذه الصور ، الخلايا التائية الخاصة بالفيروس ملطخة برباعي معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الأولى المحملة بببتيد SIV ، وبقع مشتركة ل CD8 ، وهي علامة مجموعة فرعية للخلايا التائية ولكن ليس CD20 ، وهو بروتين سطح الخلية يتم التعبير عنه على الخلايا البائية.

تم إنشاء هذا المونتاج لعدة حقول سلسلة z متحدة البؤر ، والتي تم استخدامها لقياس الخلايا الملطخة بالرباعي بأنماط ظاهرية محددة ومقصورات تشريحية مختلفة على العقدة الليمفاوية. تسلط هذه الصورة المكبرة الضوء على منطقة من العقدة الليمفاوية المونتاج تحتوي على بصيلات الخلية البائية المحددة بواسطة تلطيخ IGM. يمكن اكتشاف الخلايا الملطخة من معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الأولى من رباعي التوافق النسيجي الكبير ، والتي شارك بعضها في التعبير عن علامة تنشيط الخلايا التائية وانتشارها ، داخل وخارج بصيلات الخلية البائية.

تسمح تركيبة التلوين هذه بتحديد حالات التنشيط والانتشار للخلايا التائية الإيجابية CD8 الخاصة ب SIV ، بالإضافة إلى توطينها داخل الأنسجة اللمفاوية الثانوية. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون خمسة أيام تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الأنسجة الطازجة ضرورية للتلطيخ الناجح.

قم بمعالجة العينات في غضون 24 ساعة أو أقل بعد الحصاد ، مع إبقائها مبردة حتى التثبيت. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تلطيخ رباعي الكيمياء والكيمياء المناعية لتحديد موقع ووفرة ونمط ظاهري للخلايا التائية CD8 الإيجابية الخاصة بالمستضد في الأنسجة ذات الأهمية. لا تنس أن العمل مع العوامل المعدية يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأن الاحتياطات لمنع التعرض مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة والحد من استخدام الأدوات الحادة يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.